高效毛细管电泳法分离盐酸尼卡地平等6种药物对映体

高效毛细管电泳法分离盐酸尼卡地平等6种药物对映体

色度法是分离手性药物的首选方法。其中，高效液相色度法在目前的应用中发挥着主导作用，但手性固定相价格高、类型少、柱效率低，无法满足各种手性药物的分离需求。与高效液相色谱法相比,毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、运行成本低、有多种分离模式可供选择、抗污染能力强等优点,已发展成为分离科学中最活跃的技术之一。环糊精(cyclodextrins,CDs)及其各种衍生物(CDderivatives)是CE分离中最常用的缓冲液添加剂,在手性拆分领域获得了巨大成功。经检索,目前还未见有关使用羧甲基-β-环糊精(CM-β-CD)为手性选择剂,用CE分离盐酸尼卡地平、盐酸曲马多、酮康唑、氧氟沙星、阿替洛尔、盐酸特布他林对映体的文献报道。因此,本文作者使用CM-β-CD作为CE背景电解质添加剂,对上述6种药物进行了对映体拆分研究。考察了CM-β-CD浓度、pH、缓冲盐浓度等因素对分离的影响;考察了在含有CM-β-CD的背景电解质中加入离子液体对对映体分离的影响;最后,对分离机理进行了探讨。6种药物的化学结构式见图1。1phs-3dc精密数显酸度计CL1030毛细管电泳仪(CL101A高压电源、CL1030紫外检测器、HW-2000色谱工作站,北京彩陆科学仪器公司),pHS-3DC精密数显酸度计(上海科学公司)。弹性石英毛细管柱(50cm×50μm,i.d.,有效长度41cm,河北永年光导纤维厂),羧甲基-β-环糊精(CM-β-CD,天津博迪化工有限公司),盐酸尼卡地平、盐酸曲马多、酮康唑、氧氟沙星、阿替洛尔和盐酸特布他林对照品(中国药品生物制品检定所),其余试剂(分析纯,市售),水为二次重蒸水(自制)。2方法和结果2.1内标液、内酰胺盐酸钠zea、c.4.背景电解质:配制30mmol·L-1NaH2PO4缓冲溶液,加入一定量的CM-β-CD,用H3PO4调节至所需pH值,经0.45μm微孔滤膜过滤,备用;进样方式:重力进样5s,高度差10cm;分离电压:20kV;检测波长:盐酸尼卡地平、盐酸曲马多、酮康唑230nm,氧氟沙星、阿替洛尔、盐酸特布他林270nm;丙酮作为中性标记物;温度:室温。新毛细管柱用1.0mol·L-1NaOH溶液冲洗10min,然后用蒸馏水冲洗5min。实验开始前,依次用0.1mol·L-1NaOH溶液、水、背景电解质冲洗10min。进样间用背景电解质溶液冲洗3min后进行下次进样。2.2对照品溶液的制备分别取酮康唑、盐酸曲马多、盐酸尼卡地平、阿替洛尔、盐酸特布他林和氧氟沙星对照品5.0mg,用少量甲醇溶解并用水定容为10mL。取2mL该溶液用水稀释为10mL,制成质量浓度为0.1g·L-1的对照溶液。2.3选择不同的条件2.3.1cm--cd质量浓度的影响根据Wren等建立的毛细管区带电泳(CD-CZE)体系手性分离的数学理论模型,存在一个最佳手性选择剂浓度,能获得最大的分离度。因此,本文作者首先在pH值3.0、30mmol·L-1NaH2PO4缓冲溶液条件下,考察了CM-β-CD质量浓度分别为10、15、20、30g·L-1时对6种药物对映体分离度的影响,结果见图2。从图2可见,当CM-β-CD质量浓度增加时,盐酸尼卡地平、盐酸曲马多、酮康唑、阿替洛尔、盐酸特布他林的分离度变化不大,但氧氟沙星的分离度随手性选择剂质量浓度的改变有明显变化。同时也能看到,氧氟沙星的迁移时间随CM-β-CD的增加也有显著增加(图3)。综合考虑迁移时间和分离度,选择CM-β-CD质量浓度为15g·L-1继续研究。2.3.2ph值对耦合作用的影响pH值是影响毛细管电泳手性药物分离的重要参数。pH值对分离的影响主要包括:影响石英毛细管内壁双电子层的厚度,从而影响EOF;影响手性药物的解离状态,对于碱性药物来说,pH值影响手性药物氨基官能团的质子化程度;影响CM-β-CD的解离状态,即影响CM-β-CD的羧基的解离程度。因此,pH值影响手性分子与CM-β-CD疏水性空腔的匹配及手性分子CM-β-CD上的官能团之间的多种相互作用力,如静电作用、氢键作用等。作者在30mmol·L-1NaH2PO4缓冲溶液中,加入15g·L-1CM-β-CD,考察了pH值分别为2.5、3.0、3.5、4.0和4.5时对参数分离时间(t)、对映体选择因子(α)和分离度(R)的影响,结果见表1。由表1可知,随着pH值增加,各对映体的分离度均出现先增加后减小的趋势:在pH值3.0时,盐酸特布他林对映体的分离度达到最大;在pH值3.5时,盐酸尼卡地平、酮康唑、阿替洛尔对映体的分离度达到最大;而盐酸曲马多、氧氟沙星对映体在pH值4.0时分离度达到最大。从表1可见,最大分离度一般总是对应最长分析时间和最大对映体选择因子(α)。pH值变化主要通过2个方面影响分离时间:(1)影响电渗淌度(μeo);(2)影响分析物的有效电泳淌度(μe)。图4和表2给出pH变化对电渗淌度和对氧氟沙星的有效电泳淌度的影响。可以看出,电渗淌度随pH值的增加而增加,有效电泳淌度随pH值的增加而减小。当二者之和最小时(pH值为4.0),分析物的表观淌度(μa)最小,分析时间最长,因此在pH值为4.0时氧氟沙星的分离度最大。另外,CM-β-CD羧基的pKa约为4.0,在本文研究的pH值范围内,CM-β-CD带部分负电荷,而分析物带正电荷,他们分别向正极或负极作相对移动,也为二者结合提供了更多的机会。2.3.3nah2po4浓度对电渗活性的影响缓冲盐对改善分离、抑制吸附、控制焦耳热等均有影响。在上述优化的分离条件下,考察不同浓度的NaH2PO4缓冲溶液对分离的影响。结果表明,NaH2PO4的浓度由20mmol·L-1增至40mmol·L-1时,分离度呈现先增加后减小的趋势。浓度为30mmol·L-1时,分离度达到最大。这可能与缓冲溶液浓度增大,电渗淌度减小有关。但是当缓冲液浓度增至40mmol·L-1时,由于离子强度的过度增加,使电流增大,焦耳热增大,分离度反而下降。因此最终确定缓冲盐浓度为30mmol·L-1。2.3.4盐酸曲马多、氧氟沙星的分离度为4.使用中性环糊精衍生物作为毛细管电泳手性选择剂时,研究发现加入离子液体对分离有显著的改善作用。因此,在研究中考察了向背景电解质中加入20mmol·L-1乙基-3-甲基咪唑-L-乳酸盐(离子液体)对分离的影响(图5)。结果表明,加入离子液体使分析物的分离时间明显增加,但对不同药物的改善分离作用并不相同:酮康唑、氧氟沙星的分离度改善最大(酮康唑的分离度由2.37变为4.52,氧氟沙星的分离度由7.50变为10.13);尼卡地平、阿替洛尔、特布他林的改善不大;曲马多对映体的分离度甚至完全消失。在本研究中,离子液体对改善CM-β-CD的分离作用不显著,可能与离子液体的阳离子与带负电荷的CM-β-CD的相互作用有关。综上所述,以pH值3.5的30mmol·L-1NaH2PO4缓冲溶液(含15g·L-1CM-β-CD为手性选择剂)为背景电解质,盐酸尼卡地平、酮康唑、阿替洛尔对映体达到最佳分离,分离度分别为3.44、2.37和1.83。以pH值4.0的30mmol·L-1NaH2PO4缓冲溶液(含15g·L-1CM-β-CD为手性选择剂)为背景电解质,盐酸曲马多、氧氟沙星对映体达到最佳分离,分离度为1.50、7.50。以pH值3.0的30mmol·L-1NaH2PO4缓冲溶液(含15g·L-1CM-β-CD为手性选择剂)为背景电解质,盐酸特布他林对映体达到最佳分离,分离度为2.80。在背景电解质中加入第二种手性选择剂乙基-3-甲基咪唑-L-乳酸盐,仅酮康唑、氧氟沙星的对映体分离度大大改善,但其余4种药物的分离度未见改善,甚至有的药物分离度完全消失。3手性选择剂与药物分子的作用以环糊精(环糊精衍生物)为手性选择剂的毛细管电泳法拆分手性药物的拆分机理主要是基于手性药物各对映体与环糊精之间形成稳定性不同的主-客体包合物,具有不同的迁移速度,从而实现分离。在包合过程中,两者之间的疏水作用、范德华力(包括偶极-偶极、偶极-诱导偶极和色散力)、氢键作用等为两者手性部位的接触和包合物的形成提供了动力。有研究表明,可能是分析物的芳香环进入环糊精的疏水空腔,所以芳香环的大小和极性的大小会影响分析物进入环内的深度以及分析物与环糊精疏水腔之间作用的强弱,影响到分析物其他部位与CD边缘羟基和取代基之间的作用,从而影响CD与分析物所形成的包合物的稳定性。在本研究中,6种药物分子中均带有苯环,因此CM-β-CD对他们均有手性选择性。此外,CM-β-CD分子中含有羧基(pKa≈4),在所研究的pH范围内,CM-β-CD分子带部分负电荷,而药物带正电荷,与带负电荷的CM-β-CD之间存在静电引力。这种静电引力也增加了CM-β-CD与药物分子之间的包合作用。在含有CM-β-