我国木本植物组织培养植株再生研究现状

我国木本植物组织培养植株再生研究现状

植物器官的发生是指植物组织或细胞在组织培养条件下形成无根、根、芽和其他器官的过程。建立高效的木本植物器官发生再生植株体系难度较大,据报道,至少有30种桉树已经在离体愈伤组织培养中取得成功,然而植株再生成功的则只有12种。在果树作物中,采用化学及电融合法已经获得了柑桔、李、梨、柿、猕猴桃、苹果等多种果树的种间、属间甚至亚科之间近100个组合的体细胞杂种或胞质杂种,可是能够完成植株再生的较少。木本植物的器官发生植株再生途径可分为两类:一是先从外植体上诱导出愈伤组织,再从愈伤组织上诱导出不定芽或不定根原基的间接器官发生过程,包括从愈伤组织或悬浮培养的细胞和原生质体再生植株;二是不经过愈伤组织阶段,直接从原始外植体上诱导产生不定芽或不定根的直接器官发生。本文主要就我国林木组织培养器官发生研究方面的进展作一综述,并就目前在这一研究领域存在的问题及发展方向进行讨论与评述。1木本植物器官用纵观国内外对木本植物器官发生植株再生的研究,阔叶树的器官发生再生植株要比针叶树容易,阔叶树的器官发生植株再生中既有间接器官发生又有直接器官发生。针叶树间接器官发生植株再生的难度大,直接器官发生是针叶树器官发生植株再生的主要途径。目前已在针叶树7个属的30多种植物上获得了器官发生的幼芽和再生植株。我国对木本植物器官发生植株再生的研究,基本集中在下面几个方面:主要用材绿化树种松树、云杉、杨树、桉树、榆树、楸树、泡桐、桦树、刺槐、悬铃木等;重要果树与经济林树种苹果、李、梨、柑橘、柠檬、枣、柿、葡萄、枇杷、桃、樱桃、猕猴桃、核桃、板栗、可可、橡胶树、茶树、香枫、桑树等[2,10,15,16,17,18,19,20,21];药用植物树种杜仲、红豆山、银杏、枸杞等;珍稀濒危植物的保存与繁殖,如银杏、拱桐、四合木、绒毛皂荚、沙冬青等;以育种为目标的研究性工作(包括基因工程育种),如杨树与枸杞的抗盐性研究,杨树抗虫基因转化,橡胶、葡萄、白皮松、苹果、枣、枸杞等单倍体植株的获得,苹果、葡萄、山楂等的诱变育种,柑橘、杨桃、枸杞的多倍体育种;研究植物器官发生调控机制。以上研究多以研究影响器官发生再生植株的培养条件、外源激素、外植体的生理状态等为主。2影响木本植物器官的主要因素2.1木本植物器官分离树木的基因型是木本植物器官发生植株再生的主要影响因子。白桦不同无性系叶片的诱导率、再生植株的生根率及增殖倍数明显不同,而且不同无性系的组培苗在形态特征上的表现各不相同。对泡桐、桉树、松树、苹果等多种木本植物的研究也证实了这一点。同样外植体的来源及其所处的发育阶段或生理状态及其不同部位(极性)也是影响木本植物器官发生植株再生的重要因子。东北红豆杉茎尖能诱导出不定芽与不定根,但不定芽的形成与6-BA/IBA比值和母树树龄有关,不定根的形成主要取决于IBA的质量浓度与母树树龄。在茶树子叶柄培养中,近胚轴端不定芽的分化率高,随着子叶柄断面离胚轴距离的增大,其分化率降低。与体细胞胚胎发生相比,诱导器官发生所用外植体选择性更广,树木的茎尖、幼叶、成熟叶、茎段、胚、子叶、下胚轴、根、花器官、叶柄、髓等各个器官或组织均可用于诱导器官发生植株再生的外植体[10,17,18,19,20,21,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35]。2.2木本植物器官生物诱导生根的调控木本植物器官发生植株再生所用的培养基以MS为主,1987年陈正华统计,97种木本植物芽诱导有70种是使用MS及其修改的培养基。MS对某些植物是不利的,N69培养基是适于梨叶片再生植株的培养基。器官发生的不同时期对培养基的要求是不一样的。诱导银杏茎段愈伤组织产生最适宜的培养基为MS;分化芽的为1/2MS,而诱导根却在White培养基上。培养基的最适碳源也因植物种类和不同的诱导阶段而异。如蔗糖对苹果Melntosh品种的愈伤组织生长不利,而山梨醇则效果良好,后来证明使用果糖对愈伤组织的生长比山梨醇更好。降低培养基中矿质元素浓度和蔗糖浓度、弱光照及变温培养等是诱导不定芽生根的常用手段,但蔗糖浓度对白桦组培苗的生根率影响不大。在木本植物器官发生过程中,细胞分裂素和生长素对芽的诱导和生长发育均起着重要的作用,一般诱导不定芽的形成时细胞分裂素高于生长素的用量或只用细胞分裂素;而诱导不定根发生只用生长素或配合使用较低浓度的细胞分裂素。可是Kitahara和Caldas报道,在附加IAA1mg/L的White培养基上诱导的桉树下胚轴愈伤组织,在同种培养基上继代培养,60d后再生了根和芽。红豆杉、银杏的研究中也有类似的报道。常用的细胞分裂素有BA、KT、ZT、TDZ(噻重氮苯基脲)等,其中以BA为主。不同种类的木本植物对细胞分裂素的要求与不同激素种类和浓度对同种木本植物的作用也不一样。浓度同为0.5mg/L时,BA对山楂茎尖分化成芽的效果最佳,玉米素次之,KT最差;而为5mg/L时,使用KT的分化率为76.9%,BA为23.8%,ZT为0。对诱导不定芽发生,TDZ在某些树种表现出特别的效果。0.002~0.05mg/L的TDZ可诱导椴树、花楸、洋槐、黑核桃等植物形成大量的芽,同比效果是BA的50~100倍。笔者在苹果、杨树、木槿等植物诱导叶片直接器官发生时也得到类似的结果。NAA、IAA、IBA、NOA(萘氧乙酸)等是最常用的生长素,在诱导木本植物再生植株生根时,不同激素种类适合不同的树种。在体细胞胚胎发生中应用广泛的2,4-D、ABA在器官发生过程中却较少使用。2,4-D多用于诱导愈伤组织产生,但也有例外,2,4-D比6-BA更有利于红豆杉愈伤组织分化芽。在附加2.4-D2mg/L及LH300mg/L的white培养基上可诱导银杏胚轴切段愈伤组织及丛生芽产生,再将芽转移到加有0.05%活性炭的上述培养基中,6~10d后生根,形成完整植株。顾淑荣等在研究白皮松和油松雌配子体愈伤组织的诱导和分化时发现,只有在添加0.1mg/LABA的原诱导愈伤组织的培养基上,经过60d培养,才分化出绿色小芽。2.3有利于促进重新利用和促进再生植株再生光照、温度等培养条件对诱导木本植物器官发生再生植株起着重要调控作用。多种桉树愈伤组织都能在12h光周期条件下形成根,但在暗处没有根或芽的形成。而苹果叶片暗培养比光培养有利于促进不定梢再生。对于再生植株来说,长时间光照不足易引起再生植株的玻璃化苗的出现。另外培养基中添加的附属物质有时也起一些关键作用。银杏茎段培养中,活性炭对外植体芽的分化和增殖,具有非常重要的作用;随着活性炭水平(浓度)的提高,分化率、增殖率都呈上升趋势。孙清荣等的实验研究表明,乙烯抑制剂AgNO3浓度在0.1~8mg/L范围内对梨叶片和李子叶再生不定梢都有明显的促进作用。梁海永等发现根皮苷有利于阿月浑子组培苗根的诱导。3再生植株的生理生化特性植物通过器官发生途径再生植株的过程,同样也是外植体内部发生生理生化变化的过程,因此,了解再生植株过程中外植体内部发生的DNA、RNA和蛋白质的合成、氮同化和氨基酸代谢、碳水化合物的代谢和利用、内源激素的平衡等生理生化变化规律,有助于认识植物再生植株的本质。目前这一方向的研究正处于不断丰富和深入之中。3.1芽原基蛋白带的诱导表达蛋白质(同工酶)是基因表达的产物,可作为研究分化的指标。胡杨愈伤组织器官发生能力与特异蛋白的表达有关,随着愈伤组织形成分生细胞团块和不定芽原基,明显地表达了20kDa和55kDa蛋白带。杜克久等的研究发现由741杨茎尖诱导分化的愈伤组织中,有芽和根分化的酯酶同工酶、可溶性蛋白谱带条数比没有芽和根分化多。通过对小叶杨原生质体诱导的愈伤组织分化过程中同工酶分析,异柠檬酸脱氢酶(IDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、磷酸-6-葡萄糖脱氢酶、过氧化物酶、水解酶类中的酯酶、谷氨酸-草酰乙酸转氨酶在具有分化能力的两种愈伤组织中均表现出活性高,谱带数增多。3.2农艺还原酶系统的结构表征在形成芽的愈伤组织中与苹果酸代谢有关的酶活性高于非器官形成的组织,可产生更多的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP),还原型辅酶II(NADPH)的利用更完全,表明在器官建成组织中要求更高的还原能力。由于形成芽时消耗了大量能源,因此一般愈伤组织分化芽之前有一个淀粉积累的高峰出现。这一点已经在多种草本植物的器官发生或体细胞胚胎发生过程中得以证实。笔者在研究欧洲白桦叶片再生体系建立时,也观察到这一现象。一般认为形成芽的组织比不形成芽的组织有较高的全氮、蛋白氮、亚硝态氮,而且具有高的硝酸还原酶活性。程淑婉在小叶杨原生质体愈伤组织诱导分化的研究中却发现,分化频率高的愈伤组织中,硝酸还原酶活力低,而氨基态氮含量高,蛋白质合成剧烈。3.3外源激素调节植物再生植株及其正常发育的过程,最终是外植体内部和器官形成部位激素平衡或相互调节的结果,也就是说外源激素是通过调节内源激素的平衡而起作用的。程淑婉研究认为,通过外源激素的调节,能够诱导小叶杨愈伤组织内源激素种类增多、细胞分裂素含量高、细胞分裂素/生长素比值增高的处理,分化频率高。杨树外植体的内源IAA/ABA值高于苹果,比苹果易于形成胚性愈伤组织和诱导芽发生,苹果形成的愈伤组织则只分化出根。4细胞染色体畸变和植物激素一般认为植物组织或细胞离体培养过程中,通过器官发生再生植株能够稳定遗传外植体的基因型。这也是利用器官再生进行优良品系的繁殖与保存的遗传基础。然而大量研究结果表明,再生植株的稳定性只是相对的,细胞染色体存在着广泛的变异,这些变异包括染色体倍性变异、非整倍体的出现、染色体断裂、易位、缺失等。宁夏枸杞叶片离体培养通过器官发生途径形成再生植株,通过检查再生植株根尖细胞的染色体变异情况发现,这种发育途径中染色体变异程度大为增加,由17.71%分别增至40.95%。愈伤组织或试管苗继代时间的长短与遗传稳定性有关。欧洲冷杉的胚性愈伤组织经3a继代后,细胞畸形,染色体数为三体。再如,随赤桉再生植株继代次数的增加,2~3a后其根尖染色体正常频率会从100%逐渐降到60%。相反,青扦的胚性愈伤组织继代3a后,它的染色体倍性十分稳定,仍具有旺盛的分化能力。植物细胞或原生质体经愈伤组织再生植株的过程中,同样伴随着广泛的变异。植物组织培养过程中植株的再生过程也是植物激素的积累过程。一般来讲,组培苗的增殖率越高,植物激素在植物体内的积累量也相对较多,产生无性系变异的机率也就越大。某些情况下,体细胞无性系变异可归因于生长调节物质浓度的异常。如在苹果茎尖组织培养过程中,高浓度的BA会诱导组织培养苗后代矮化。木本植物体细胞无性系变异是遗传变异的重要来源之一,对它加以正确利用,可获得后代稳定遗传的一些优良品种。如:杨树、枸杞等一些耐盐无性系的获得;多种木本经济林木胚乳培养获得三倍体再生植株,如柑橘、柿、苹果、桃、猕猴桃、梨、枸杞、核桃等;杨树抗病及抗除草剂无性系、北美五针松抗松疯锈病的新品系等的培育。这些也极大地丰富了育种资源。5过农杆菌诱导的基因转化通过基因工程进行品种改良和目的育种是现代生物技术在农林业应用最为广泛的技术之一。对应木本植物再生植株方式的不同,基因转化的方式也有区别。载体法是应用最广的植物转基因方法,主要是通过农杆菌介导的方法进行基因转化。接受农杆菌侵染的木本植物受体常用的有受伤叶片、茎段、叶柄、子叶、胚轴及体细胞胚、胚性愈伤组织等。利用叶片、茎段、叶柄直接再生植株的方式已在欧洲黑杨、毛白杨、苹果、樱桃、猕猴桃、柑橘、葡萄、桃、白桦、尾叶桉等树种上得到成功;通过悬浮培养细胞或胚性愈伤组织与农杆菌共培养,得到的转基因再生植株有挪威云杉和火炬松、柑橘、甜樱桃、番木瓜、桃;以幼胚或成熟胚为外植体获得转基因再生植株的有杏、欧洲李、桃、葡萄、柑橘。另外还有扁桃、树莓、黑茶子、芒果、杂交山杨、橙、日本柿、橡胶树、欧洲落叶松、杂种落叶松、桑树等。6本植物存在的问题木本植物植株再生的研究起步较晚,经近几十年的研究,无论在技术上还是在方法上都取得了很大进展,但仍然面临着一些问题。首先,目前对木本植物的研究远不如对作物和草本植物的研究深入。据统计,全世界诱导出小苗的植物约4000余种,木本植物只有近300种。第二,研究的不平衡发展。主要表现为:在阔叶树中重影响因子轻再生机制的研究、针叶树中重体细胞胚胎发生轻器官发生的研