铁皮石斛的离体培养

铁皮石斛的离体培养

兰科是一种多年生草本植物，通常生长在潮湿的森林树干和岩石上。目前发现了1500多种石斛兰，76种在中国，39种在药物中。铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo=DendrobiumcandidumWallichexLindley)是《中华药典》中收载的5种石斛属植物之一。石斛的药用部分是新鲜或干燥茎,具有益胃生津、滋阴清热的功效。铁皮石斛的种子极小、无胚乳,自然条件下需与某些真菌共生才能萌发,很难用实生苗栽培;而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低,加上人为的过度采挖和破坏生境,其资源已濒临灭绝,被国家列为重点保护的药用植物之一。近20年来,国内学者对铁皮石斛的组培研究非常重视[1~7],铁皮石斛外植体原球茎的诱导率低,但原球茎增殖和分化容易,分化苗弱,生根苗伴大量丛生苗,移栽成活率低。笔者就外植体建立无菌系后,研究了无菌苗快速形成规模过程中相关技术,着重控制培养条件,获得优良的原球茎,培育健壮的试管苗,相关研究内容国内未见报道。1材料和方法1.1ms+6-ba2.2.0-1/2.4将铁皮石斛茎段诱导出的无菌苗依苗的高度分切成2~3节,2个假鳞茎为一节,切除过长的根系,留约1cm长的根,从根茎处将根、茎分开,茎以下称为根蔸,以上为茎段。上述切段外植体分为带顶芽的茎段、茎段和根蔸。原球茎诱导培养基:(1)MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L;(2)MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L;(3)MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L;(4)MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L;(5)MS+6-BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L;(6)MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L;(7)MS+6-BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L。生根培养基:(1)1/2MS+NAA0.5mg/L;(2)1/2MS+NAA1.0mg/L;(3)1/2MS+NAA2.0mg/L;(4)1/2MS+IBA0.5mg/L;(5)1/2MS+IBA1.0mg/L;(6)1/2MS+IBA2.0mg/L;(7)1/2MS+NAA2.0mg/L+香蕉50g/L。1.2方法1.2.1培养基和培养基外植体诱导试验以基本培养基、生长调节物质设计成三因素二水平的正交试验,L4(23)表头设计见表1。培养基pH5.8,光照强度1500lx,光照时间12h/d,培养温度为(25±1)℃,蔗糖浓度为30g/L。将根蔸、茎段和带顶芽的茎段分别接入各诱导培养基,14d后开始观察各外植体的生长、叶色变化、丛芽诱导和原球茎发生情况,以繁殖系数进行正交分析。1.2.2原球茎重量用感量0.01g的托盘扭力天平分别称取接入原球茎重量和调查期原球茎重量,每组培养基接7瓶,每瓶1g左右。用增殖质量倍数(调查期原球茎重/始接原球茎重)、原球茎生长情况、分化能力为依据进行评判。1.2.3原球茎生长情况接入增殖培养基中的原球茎分别放置于(23±1)℃、(25±1)℃、(27±1)℃,其它条件相同的环境中培养,30d后调查原球茎生长发育情况,统计数据用LSD法进行统计分析1.2.4生根、小苗分化及苗高选取大小相近的无菌试管苗植株,去除基部老化组织及生长的小根,接入生根培养基,放置于25~27℃和22~23℃温度下进行生根培养,40d后观察生根、小苗分化及苗高。将3cm以上的小苗,切除根后接入生根培养基,pH5.8。糖浓度20g/L,每处理10瓶,每瓶接10个小苗,接种后置于温度为(23±1)℃,光照强度2000lx,光照时间12h/d的培养室中进行培养。14d后开始观察根的生长、萌动及伸长情况。40d后统计分析各处理生根率和每株根数。2结果与讨论2.1铁皮石斛丛芽诱导的正交分析40d后各类外植体均能诱导出丛芽或原球茎,诱导率达100%,以丛芽为主,原球茎较少(图1)。正交分析结果(见表2)表明:影响铁皮石斛丛芽诱导数量的主要因素是细胞分裂素6-BA的浓度,丛芽的发生数与6-BA浓度成反比,而与生长素NAA和盐浓度的关系不大。铁皮石斛丛芽诱导的最佳组合为:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L。2.2丛芽的发生机制3类外植体接入诱导培养基中的表现各异,10d可以看到茎段和带顶芽的茎段的叶片开始退色变黄,直至枯死脱落,茎段鲜绿,只有少数绿叶。带顶芽的茎段也只剩顶部叶片,黄叶的脱落并不影响丛芽的发生,约15d后开始在各外植体的底部有不定芽产生,20d能明显看到丛芽。茎段和带顶芽的茎段只产生丛芽,且茎段产生的丛芽多于带顶芽的茎段(表3),这可能是去除顶端优势后更利于丛芽形成的原因。以根蔸为外植体不仅诱导出大量的丛芽,而且伴生有原球茎的产生。以此培养基(MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L)进行增殖培养时,原球茎的增殖率极高,分化苗的质量和数量都非常理想(图2)。2.3-ba对原球茎增殖的影响经过40d的培养发现,铁皮石斛原球茎增殖受细胞分裂素6-BA和生长素NAA的共同影响(见表4)。在合适的生长素存在下,6-BA对原球茎增殖存在小幅波动,呈先降后升的趋势;在较低浓度下,随6-BA浓度的增加,原球茎的增殖系数反而降低,随着6-BA浓度的进一步增加,原球茎的增殖加大,以后6-BA浓度增加而原球茎的增殖系数没有明显提高;6-BA浓度增加,增殖系数的离散性加大,原球茎的类型发生变化,含水翠绿色的原球茎增多,颗粒型的原球减少。在一定浓度的6-BA存在下,NAA的浓度与原球茎的增殖呈反比,而与球茎的死亡率呈正比。单一的细胞分裂素6-BA对原球茎的增殖不及附加适当浓度NAA的协同作用。原球茎的增殖不仅与培养基激素的配比有关,而且与原球茎的类型密切相关,颗粒型、浅黄绿色的原球茎增殖系数小,分化好,而含水呈翠绿色的原球茎增殖倍数高,是前一种的2倍,但分化差。2.4温度对原球茎增殖的影响培养30d后,温度的高低与原球茎的增殖存在显著差异(见表5),较高的温度和较低的温度都不利于原球茎的增殖,温度过高原球茎增殖缓慢,原球茎的生长不适应,部分原球茎死亡。较低的温度同样表现为原球茎的增殖速度降低。原球茎在不同温度中的增殖与原球茎的类型相关,各处理表现出相似的结果,即含水翠绿原球茎增殖比颗粒浅黄绿色原球茎要快。2.5温度对分生苗数量的影响在2种不同温度下培养40d,铁皮石斛表现出极高的分生能力,即使在生根培养时也不例外,在苗的基部或假鳞茎的节间都可能产生分生苗,并伴随有气生根,结果见表6。分生苗的多少与温度密切相关,温度越高,分生苗的数量也越多。在不同温度条件下,试管苗的平均根条数接近,无明显差异;而生根苗的生长发育受到影响,在较低温度下,生根苗更健壮,高大。2.6石斛对每株根的影响将高3cm以上的苗,接入以下生根培养基中,无菌苗开始表现出不适应,基部1~2叶片变黄,随培养时间延长而脱落,其它叶片颜色慢慢转绿,随之根也从基部长出。在适宜的光温条件下,15d左右可以看到有根从基部长出,随时间的延续,根也随之伸长,每株根数增加,在根端上有根毛,根绿色而细长。40d后的石斛易生根,生长素有利于根的形成,其浓度与每株根条数呈正相关;采用NAA的培养基略优于IBA,附加香蕉泥有利于根的形成和每株根数的增加(见表7),同时根变得短而粗,根的色泽变浅,植株变得更粗壮(图3、4)。2.7生根苗的移栽在适宜假植的季节(气温15~30℃)。将生根苗移到室外,作好遮阴,避免太阳直射,14d后打开瓶盖炼苗,直至培养基表面有轻度污染,小心取出生根苗,洗净根部培养基,再用多菌灵或甲基托布津1000倍液浸泡根部10min,自然通风晾干至根系发白,移栽于已消毒的水苔或碎树皮为基质的小钵中,50%~70%遮阴,保持80%的湿度,细心管理,成活率能达90%以上(图5)。3质控措施:产生原球茎,增殖和分化铁皮石斛的原球茎启动相对较难,而原球茎的增殖和分化容易,少量添加植物激素,可获得大量的分化苗,生产健壮的试管苗是移栽成活的关键。铁皮石斛原球茎增殖过程中产生2种类型,原球茎的类型与增殖和分化密切相关,具有高增殖倍数的含水翠绿型原球茎分化率较低