盐酸小碱对大鼠肝微粒体p450同工酶和多药耐药基因的影响

盐酸小碱对大鼠肝微粒体p450同工酶和多药耐药基因的影响

氨基cyclospoin（csa）是大多数移植手段中使用的免疫抑制剂之一。在临床实践中，假设盐酸小黄碱（ber）可显著增加csa的血药浓度。为了阐明Ber和CsA相互作用的机制,本文研究了Ber及其与CsA合用对大鼠肝脏细胞色素P450(cytochromeP450,CYP)同工酶和多药耐药基因mdr1a、mdr1b的影响。1材料和方法1.1试剂:李碳酸钠amenge-pa盐酸小檗碱为上海天平制药厂产品,批号990801;环孢素A为华北制药集团有限责任公司生产,批号990601;酮康唑为西安杨森制药有限公司产品,批号000222565;红霉素(erythromycin),氨基比林(aminopyrine),6-磷酸葡萄糖二钠,6-磷酸葡萄糖脱氢酶均为Sigma公司产品。牛血清白蛋白(BSA)、氧化型辅酶Ⅱ(NADP)、甲醛、乙酰丙酮、甲醇等为国产分析纯试剂。TRIZOLRNA提取试剂盒为美国Gibco公司产品;PCRMarker为华美生物工程公司产品;Titan单管逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒为瑞士Roche公司产品。1.2各组患者血清基纤维素钠cmc的表达水平♂大鼠,体重130～150g,由本院实验动物中心提供,随机分为质量分数为50mol·L-1羧甲基纤维素钠(CMC)溶媒对照组、150mg·kg-1酮康唑阳性对照组、100mg·kg-1Ber组、200mg·kg-1Ber组、45mg·kg-1CsA组、100mg·kg-1Ber+CsA组、200mg·kg-1Ber+CsA组。分别灌胃给药6、12d后处死动物,取肝脏制备微粒体和RNA。1.3微粒体制备采用钙沉淀法制备肝脏微粒体,肝脏组织匀浆后于4℃200×g离心10min,取上清液9000×g离心20min,再取上清液与88mmol·L-1CaCl2混匀,冰浴5min,4℃27000×g离心15min,洗涤沉淀1次,微粒体以0.25mol·L-1蔗糖溶液重悬,-40℃保存备用。1.4氨基比林n-脱甲基酶活性测定红霉素N-脱甲基酶(ery-thromycinN-demethylase,ERD)活性和氨基比林N-脱甲基酶(aminopyrenceN-demethylase,ADM)活性测定用分光光度法,氨基比林和红霉素的终浓度分别为0.4mmol·L-1、8mmol·L-1。蛋白含量测定采用Folin酚试剂法。1.5同工酶基因检测按TRIZOLRNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA,所有引物(Tab3)均由美国Gibco公司合成。用Titan单管RT-PCR试剂盒进行逆转录和PCR扩增反应(珠海Hema8000CDNA扩增仪)。用图像分析仪测定电泳照片上各条带的密度值,计算各同工酶基因与内对照环孢素受体(cyclophilin,CYC)基因的比值。由于扩增的mdr1b基因和CYC基因大小十分接近,故分别进行扩增。1.6统计方法结果以x¯±sx¯±s表示,组间比较用t检验。2结果2.1在微粒体中随时间的应用从Tab1可见,给药6d后,与溶媒对照组比较,酮康唑阳性对照组可使大鼠肝微粒体ERD酶活性降低(P<0.05)。100mg·kg-1Ber组ERD酶活性虽有下降,但差异无统计学意义(P>0.05),当Ber剂量增至200mg·kg-1时则可明显抑制ERD酶活性,表现为剂量依赖性。45mg·kg-1CsA组、100mg·kg-1Ber+CsA组、200mg·kg-1Ber+CsA组对ERD酶活性均有抑制作用,同时200mg·kg-1Ber+CsA组抑制作用高于CsA单用组(P<0.01)。给药12d后,各用药组肝微粒体ERD酶活性进一步降低,Ber单用时表现为明显的剂量依赖性,200mg·kg-1Ber+CsA组抑制作用高于CsA单用组(P<0.01)。但是,Ber作用的时间依赖性不甚明显,给药12d时,100、200mg·kg-1Ber组与给药6d组差异无显著性(P>0.05)。2.2对adm活性的影响从Tab2可见,给药6d时,酮康唑组、100mg·kg-1Ber和200mg·kg-1Ber单独给药组对大鼠肝微粒体ADM酶活性无影响(P>0.05),而45mg·kg-1CsA组、100mg·kg-1Ber+CsA组、200mg·kg-1Ber+CsA组对ADM酶活性均有抑制作用,而且200mg·kg-1Ber+CsA组抑制作用高于CsA单用组(P<0.01)。给药12d时,酮康唑组、100mg·kg-1Ber组对ADM活性仍无影响,其余各用药组则对ADM活性有抑制作用。从Tab2还可看出,随着Ber给药时间的延长和剂量的增加,对ADM活性的抑制程度亦增加(P<0.05),有明显的时间依赖性和剂量依赖性。2.3大鼠肝脏cyp3a1/cyc、csa的比对给药12d后,酮康唑阳性对照组可使大鼠肝脏CYP3A1/CYC的比值降低(P<0.05)。100mg·kg-1Ber组则对CYP3A1/CYC的比值无影响,其余各组CYP3A1/CYC的比值均降低(P<0.05),而且200mg·kg-1Ber+CsA组抑制作用高于CsA单用组(P<0.05)。结果见Tab4、Fig1。给药12d后,酮康唑组可使大鼠肝脏CYP2E1/CYC的比值降低(P<0.05)。100mg·kg-1Ber组则对CYP2E1/CYC的比值无影响,其余各组CYP2E1/CYC的比值均降低(P<0.05)。结果见Tab4、Fig2。给药12d后,各组大鼠的CYP1A1基因均未检出,但内对照CYC基因均可见表达。2.4mdr1b/cyc的比值对表1的影响给药12d后,与对照组相比,酮康唑组可使大鼠肝脏mdr1a/CYC、mdr1b/CYC的比值降低(P<0.05),100mg·kg-1Ber组则对其无影响,其余各组的mdr1a/CYC、mdr1b/CYC比值均降低(P<0.05)。结果见Tab5,Fig3、4。3原因三:cyp3a的活性长期使用CsA的给药途径主要是口服,而CsA的口服吸收差异极大,其绝对生物利用度仅为20%～50%,大鼠用药后的生物利用度为10%～30%。临床可见一部分患者CsA用量虽高达8mg·kg-1·d-1,但血浓度仍达不到治疗窗。CsA价格十分昂贵,利用Ber增加CsA血浓度可使移植受者服用CsA的剂量减少,而且在升高CsA血浓度的同时,Ber并不增加CsA的毒性反应。CYP3A是参与口服药物首过效应的主要酶系,也是造成药物间相互作用的重要原因。红霉素脱甲基酶是一种细胞色素P450同功酶,测定此酶主要反映了CYP3A的活性。CsA是公认的CYP3A4底物,本文结果表明CsA亦是CYP3A抑制剂,这与其在临床治疗中表现出的自身抑制现象相符;Ber对ERD活性表现出剂量依赖性抑制,Ber与CsA合用较CsA单用对ERD活性有更强的抑制作用。在成人肝脏中CYP3A4是CYP3A亚族最主要的亚型,而在大鼠和小鼠肝脏中CYP3A亚族最主要的亚型为CYP3A1和CYP3A2。RT-PCR结果表明:Ber在较大剂量时对CYP3A1基因有明显抑制作用,其与CsA合用较CsA单用对CYP3A1基因的表达有更强的抑制作用。上述结果提示:Ber可能是CYP3A抑制剂,抑制CYP3A的活性而减少CsA在肝脏的代谢速率,可能是Ber增加CsA血浓度的机制之一;Ber与经CYP3A代谢的药物合用时,尤其长时间大剂量应用可能产生药物相互作用。氨基比林N-脱甲基酶主要反映了CYP1A1、2B1、2C11的活性,本研究结果表明,Ber在较大剂量时对ADM活性有明显抑制作用,而Ber与CsA合用组尤其显著。各组RT-PCR分析却未能检出CYP1A1基因的表达。生理条件下CYP1A1基因含量极少,而Ber、CsA乃酶抑制剂,故各组CYP1A1基因难于检出,此结果与文献报道一致。CYP2E1代谢底物达70多种,其中大部分为前致癌物和前毒物,小部分为临床药物,如氯唑沙宗、乙醇、茶碱、氨苯砜等。人和动物的CYP2E1活性十分近似,迄今发现所有CYP2E1的底物在人和动物中都是相同的。RT-PCR结果提示:Ber、CsA单用和两药合用均可抑制大鼠肝脏CYP2E1基因的表达。Ber抑制CYP2E1基因的临床意义有待进一步研究。人MDR1基因的产物是P-糖蛋白(P-glycoprotein),其过量表达与肿瘤细胞的多药耐药性有关。P-糖蛋白同时存在于CYP3A大量表达的细胞内如肠细胞和肝细胞,它可减少药物在肠道的吸收,也可通过肝细胞膜增加药物的消除。CYP3A的底物或调控剂与P-糖蛋白底物或调控剂常常是共享的,如CYP3A的底物钙通道阻断剂、抗真菌药、免疫抑制药等亦可与P-糖蛋白发生作用,影响CYP3A4的因素也能影响P-糖蛋白的表达,但P-糖蛋白在药物代谢与相互作用中的地位研究尚少。与人类不同,大鼠具有两个编码P-糖蛋白的基因,分别是mdr1a和mdr1b,它们共同发挥着人MDR1同样的功能。本研究表明,Ber在较