小麦转基因研究进展

小麦转基因研究进展

1992年，vasil等人以长期培育的假种子为外植体，将gus和bar基因移植到小麦品种“pavon”，并获得了世界上第一个牛奶转世。迄今为止,在获得的转基因小麦植株报道中,基因枪法占绝大多数,其次是根癌农杆菌介导法,转化率通常为1%-8%。小麦转基因技术的广泛应用实现了外源基因定向转移,在一定程度上补充或改进了传统的育种方法,打破基因流的界限,大大缩短育种年限,为快速培育小麦新品种提供了一条有效的新途径。小麦是转化难度较大的单子叶植物之一,其转基因技术研究起步较晚,近20年来经过许多学者的不懈努力,已取得了长足的进展。利用不同的转化方法已将抗病虫、抗逆性、改善品质和雄性不育基因等导入小麦,并获得一批转基因小麦品系,部分品系已经进入环境释放阶段。由于小麦是异源六倍体,其基因组相对较大,遗传背景复杂,基因型依赖性强等,目前转化率仍然较低。本文论述了当前小麦遗传转化的表达载体(如启动子及选择标记基因)、转化目标基因、受体材料以及主要转化方法等方面的研究进展,针对当前小麦转基因研究存在的问题进行讨论,为利用基因工程对小麦进行遗传改良研究提供参考。1利用基因计算机进行材料的转化小麦遗传转化常用的表达载体主要是由pBI121、pMON505、pCAMBIA3301、pRTL2和pPZP212系列改造形成的。Cheng等首次利用农杆菌介导法将携带有双元表达载体pMON18365质粒导入小麦,获得了转基因小麦。李艳等用玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC基因片段替换双元表达载体pCAMBIA3301上的GUS基因,构建双元表达载体p33012pepc,通过基因枪介导法将其导入小麦,实时定量PCR分析表明玉米PEPC基因已整合到小麦基因组中,且外源基因在转基因植株中既有单拷贝插入,也有多拷贝整合。李根英等成功地构建了植物高效表达载体pFUBPaPb,该载体携带籽粒硬度Pina、Pinb融合基因,以Ubiqutin为启动子,Ω和poly(A)为增强子,bar基因为筛选标记。通过基因枪转化也获得了转基因植株。在小麦遗传转化的表达载体构建上,以玉米Ubi-1、CaMV35S和水稻Act1作为启动子较为普遍,以β-葡萄甘酸酶基因GUS和氯酶素乙酰转移酶基因CAT等为报告基因。转基因小麦选择标记基因通常有bar、nptII、manA(pmi)、Cah、gst27、mopat、popat、CP4和GOX,筛选剂一般使用Bialaphos、Glufosinate、G418和Glyphosate等。邢莉萍等构建由Ubi-1强启动子控制下的Ta-Tlp基因的表达载体pAHC-TlP,并通过基因枪法转化扬麦158的幼胚愈伤组织,经过除草剂筛选和T0、T1和T2子代相关性状分析表明,转基因后代能够延缓白粉病的发病进程。然而这些选择标记基因属于抗生素或除草剂类,人们担忧它们的存在会给环境和食品安全带来潜在的危害。选择并利用无标记基因或者花色素苷基因作为选择标记基因,从而避免引入抗生素或除草剂基因。Chawla将花青苷调控基因B和C1利用基因枪法转入小麦,通过对转化受体及其细胞的颜色来选择转化子。Xuan等利用基因枪法轰击预处理过的小麦幼胚盾片,将携带有新型标记基因AtMYB12质粒pBI121-MYB12转移至小麦中,经过大约6周的培养,获得了胚芽鞘为紫色再生植株。与GUS和GFP相比,AtMYB12基因作为筛选标记,对再生植株的检测更清晰、更方便。因此,利用AtMYB12基因作为小麦转化体筛选的标记基因,安全简便,廉价高效。2小麦基因的转录和测序技术随着人们对小麦转基因技术的深入的研究,一些有重要利用价值的基因被应用于小麦遗传转化。按转入目标基因的功能可分为以下几种类型:(1)抗除草剂基因,如bar、EPSPs、Bxn、CP4和GOX等。世界上第一株转基因小麦——抗除草剂基因bar小麦,是由美国科学家Vasil于1992年通过基因枪法获得的。(2)改良品质基因,如高分子量谷蛋白亚基基因1Ax1、1Dx5、1Dx10、重组高分子量谷蛋白亚基Dy10-Dx5基因、籽粒硬度基因Pina和Pinb等。Martin等将Pina-D1a转入小麦品种Bobwhite,3个转基因小麦株系随着Pina在转录水平表达量升高,籽粒硬度明显变软。(3)抗病虫基因,如病毒外壳蛋白基因、雪花莲凝集素基因、藜芦醇合成酶基因、玉米Ds与Ac转座子及大麦Mlo反义基因等。燕飞等构建以Emu启动子的高效表达载体pPPI45(携带由BYDV-GPV株系复制酶基因部分序列和外壳蛋白基因序列构建成复合发夹RNA结构),利用基因枪法转化小麦幼胚愈伤组织细胞,获得了整合有外源基因的小麦再生植株,对再生植株进行接种大麦黄矮病毒感染试验,其中6株表现为高度抗性。(4)抗逆及提高产量相关基因,如BADH、DREB转录因子、拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1、IPT基因等。奚亚军等利用花粉管通道法将叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT导入普通小麦西农1376,通过对再生植株的叶片细胞分裂素含量、叶绿素含量、叶片衰老进程及农艺性状分析,初步证明PSAG12-IPT基因在部分转基因小麦的衰老叶片中特异表达,能够明显的抑制叶片的衰老。(5)雄性不育基因,如核糖核酸酶类基因Barnase等。王瑞霞等利用改良的穗茎注射法将反义PLD-γ基因导入普通小麦兰考906,获得的转基因植株经特异PCR扩增和PCR-Southern杂交技术分析表明,该基因已整合到小麦的基因组中。转基因株系的成熟期明显比受体提早4-8d;转化株系后代中存在完全的雄性不育现象。3小麦外植体的基因外源基因小麦遗传转化的受体有幼胚、成熟胚、幼胚或成熟胚的胚性愈伤组织、悬浮细胞、盾片组织、幼穗、茎尖组织和花粉等。高效的再生体系是获得转基因小麦的前提,因此建立高效、完善的小麦组织培养体系,对小麦转基因研究至关重要。在早期的小麦转基因技术研究中,由于悬浮细胞及原生质体再生困难,致使电击法介导的小麦遗传转化受到了限制。幼胚、幼胚愈伤组织和成熟胚与其他的组织作为外植体相比,在愈伤组织的诱导和再生频率方面具有更强的优势,在根癌农杆菌介导的基因转移中常用这三种材料作为转化受体。成熟胚作为外植体具有取材方便,不受季节限制等优点,是小麦遗传转化常用的外植体,然而其再生体系研究尚未成熟,植株再生率较低。幼胚的愈伤组织诱导率和植株再生率均较高,被认为是比较理想的受体材料,已报道的转基因小麦基本上以幼胚为主。然而由于幼胚取材受到季节的限制,所取材料的生理状态不能保持一致,给遗传转化工作带来许多不便。Cheng等以幼胚、幼胚愈伤组织和成熟胚为受体材料,利用根癌农杆菌介导法成功地获得了转基因植株。付永彩等利用根癌农杆菌介导法将大麦黄矮病病毒CP基因转入到小麦不同的外植体中(幼胚、茎尖、成熟胚和花药),拓宽了农杆菌转化的受体范围。董福双等尝试以小麦芽生长点为受体,利用基因枪法将外源基因GUS和BADH/BAR导入到小麦基因组中,获得了再生植株。GUS瞬时表达表明,以生长点数统计,转化率达5.7%-8.6%;再生植株PCR扩增分析表明外源基因已整合至小麦基因组中。4农杆菌法、花粉管通道法小麦转基因方法主要有农杆菌介导法、基因枪法及花粉管通道法等。目前在小麦遗传转化中应用最多、效果最好的仍然是基因枪法,绝大多数转基因小麦是采用该方法获得的。农杆菌法在转基因小麦中的应用也日趋成熟,而花粉管通道法也以其特有的优点受到重视。近年来,随着低能离子束介导转基因技术研究的不断深入,目前已在小麦遗传转化中也逐步得到了应用。4.1对小麦基因的检测基因枪法又称微弹轰击法,以火药爆炸、高压放电或高压气体为驱动力,将载有外源DNA的金粉(或钨粉)等金属微粒加速射入受体细胞或者组织中,从而将外源DNA分子导入受体细胞。自1992年Vasil等利用基因枪轰击获得世界上第一株转基因小麦以来,基因枪法仍然是当今小麦转基因技术的主流方法。Becker等分别以未成熟胚和幼胚盾片为外植体,通过基因枪法获得了抗除草剂转基因小麦。基因枪法的建立推动了小麦转基因技术的发展,利用基因枪法已将耐除草剂、抗病、抗虫、品质改良及雄性不育等基因导入小麦中。许多因素影响基因轰击后转基因植株的再生,其中最关键的是轰击盾片组织时,不能伤害受体组织,以免体细胞胚发生能力的下降。刘永伟等采用基因枪共转化法将双功能基因(小麦黄花叶病毒的复制酶基因Nib8和具有广谱抗病性的ERF基因W17)转入小麦扬麦品种,获得具有综合抗病性的转基因材料。王华忠等在转化试验前,利用玉米花青素苷合成调节基因C1-Lc作为报告基因,通过GUS瞬间表达后愈伤组织表面红色斑点的统计分析,并对基因枪法遗传转化的参数进行优化,基因枪参数组合为金粉直径1μm;每枪金粉用量500μg;氦压1100psi;可裂膜与受体膜距离9.5mm;载体膜与阻挡网距离16mm;受体与阻挡网距离9cm;真空度28cmHg,所获得的小麦基因瞬间表达频率最高。基因枪法以其受体来源广泛,方法简单等优点,成为迄今为止小麦转基因的主要方法。然而基因枪法尚存在一些不足,如易形成嵌合体、多拷贝整合过程中会出现共抑制和基因沉默现象、外源基因在后代中易丢失、试验所需的费用昂贵等,限制了基因枪法的普遍应用。4.2外源基因的整合1983年Zambryski等利用农杆菌介导法获得了世界上第一例转基因植物——烟草。Horch等建立了农杆菌介导的叶盘转化法,该法在双子叶植物遗传转化中得到了广泛的应用,先后成功获得了转基因马铃薯、番茄和拟南芥等。过去认为对于单子叶植物,特别是以小麦为主的禾本科作物,不是根癌农杆菌的天然寄主,不能转入Ti质粒上的T-DNA,因而使用农杆菌转化单子叶植物较难成功。随着对农杆菌转化植物细胞的原理深入系统的研究,发现农杆菌对单子叶植物侵染的不敏感性,可能是由于单子叶植物创伤后,在伤口附近往往发生木质化或硬化,造成内源信号分子相对不足,不能形成足够的诱导vir区基因表达的酚类化合物。但通过添加外源信号物质如乙酰丁香酮(AS)及其衍生物等可以促进农杆菌在小麦培养细胞上的吸附性,从而大大提高遗传转化率。1997年Cheng利用根癌农杆菌C58(质粒pMON18365携带GUS基因和NPTⅡ基因),分别侵染小麦的幼胚、幼胚愈伤组织和成熟胚,经过培养后,3种外植体均获得了再生植株。组织化学检测以及Southernbolt杂交分析表明,外源基因已整合至小麦植株中,并能在小麦中稳定表达和遗传。陈立国等利用农杆菌法将携带有BG2基因和GUS基因导入到成熟胚愈伤组织,研究表明运用超声波处理或真空处理可以提高转化效率。小麦转基因技术也常用于进行新基因功能的分析,Daniel以小麦的幼胚为受体,利用根癌农杆菌介导法将GBSSI基因(限制性淀粉粒合成酶)转移至小麦中,Southernblot杂交分析表明,外源基因已整合至小麦基因组中。农杆菌介导法与基因枪法相比,具有操作简单、成本低、可转移较大片段DNA,外源基因的整合多为单拷贝,遗传稳定性好,后代多数符合孟德尔遗传规律等优点,在小麦转基因研究中被广泛应用。然而在根癌农杆菌介导的小麦遗传转化中,由于受到外植体基因型、农杆菌侵染浓度、侵染时间、共培养时间、载体类型及筛选方式等因素的影响,目前仍然存在转化率低的问题。4.3方差分析和基因整合20世纪80年代初,我国学者周光宇成功地将外源海岛棉DNA导入陆地棉,培育出抗枯萎病的栽培品种,创立花粉管通道法。1993年曾君祉等报道了利用花粉管通道法将携带GUS标记基因的质粒pBI121转化普通小麦小山3号,获得了转基因小麦,对转基因植株后代进行GUS组织化学分析和Southernblot杂交鉴定,证明GUS基因已整合到小麦植株中,并能在植物体中表达。欧巧明等通过花粉管通道法将长穗偃麦草DNA导入到冬小麦陇鉴127中,对后代产生的变异类型进行连续选择和抗病性鉴定。结果表明,D1、D2代各性状产生变异明显,D3代基本趋于稳定;抗病性鉴定表明,变异后代有个别表现对条锈病免疫或高抗,部分材料兼抗白粉病。梁高峰等利用花粉管通道法将Prd29A:DREB1A融合基因(调控对干旱、高盐、低温逆境应答相关基因表达的蛋白质)导入到温麦19,获得了含有外源基因的转基因植株。通过GUS组织化学分析和PCR检测证明,融合基因Prd29A:DREB1A已经整合至再生植株的基因组中。王永芳等利用花粉管通道法,将谷子抗逆相关基因DNAj转入小麦中,并对授粉方式、柱头处理方式、质粒DNA浓度及DNA稀释试剂等因素对结实率的影响进行了对比。结果显示,授粉方式对结实率的影响有显著差异,而其他条件下结实率均未无显著差异;对所获转化体PCR检测表明,仅有1株小麦扩增到目的基因片段。花粉管通道法在小麦遗传转化中有效地利用了自然生殖过程,不受受体基因型和愈伤分化能力的限制,在整株水平上进行转化,难度小,简便易行,在大田、温室盆栽中即可进行,因此受到了越来越多小麦育种工作者的青睐。但花粉管通道法介导的小麦转基因技术易受大田环境条件影响,经验性强,重复性差,转基因植株后代情况复杂,给转化体的筛选带来很大的难度。4.4低能重离子束的小麦品种该方法1989年由余增亮提出,1993年运用到水稻转基因中。2000年吴丽芳等利用低能离子束介导法将携带有GUS基因的质粒导入到小麦的成熟胚愈伤组织中,并获得了抗性植株。PCR扩增和Southernblot杂交检测证明,外源基因GUS已整合到小麦的基因组中,首次证明了离子束介导小麦遗传转化的可行性。同年,利用该方法将水稻几丁质酶基因RCH8转入3个小麦品种中,分别获得了转基因植株,经Southernblot交证实外源RCH8基因整合至小麦中,再生植株的叶片提取物质,表现出对小麦赤霉病的抑制作用。聂利红等借助离子束介导法将大豆DNA转移至普通小麦中,并对影响离子束介导的遗传转化因素如受体小麦品种、供体大豆品种、DNA浓度和浸泡时间进行了正交试验。方差分析表明,受体小麦品种对转化效果的影响较大,其余因素对转化效果的影响均较小。低能离子束介导的外源DNA直接转化技术,离子注入之后经DNA处理的小麦种子,直接发芽成苗,获得转化植株。该方法不仅绕开了繁琐的组培过程,而且以小麦成熟种子为受体,取材不受季节和小麦生长期的制约,是其他方法所不具备的优点。然而离子束注入过程需要在真空条件下进行,这就使得一些含水量较高的受体材料受到了限制。目前该技术的生物学机理和应用研究起步较晚,还有待于从其广度和深度上进一步研究。5小麦基因外源基因的生物安全性研究亟待加强虽然小麦转基因技术已经开展很多年,目前小麦遗传转化的效率仍然较低,至今还没有培育出用于生产的转基因小麦品种,主要原因如下:(1)小麦本身为异源六倍体植物,遗传背景复杂,阻碍了小麦遗传转化的进程。(2)缺乏有效的受体及高效的受体再生体系,限制了小麦转基因研究快速发展。小麦组织培养再生率低,且有较强的基因依赖性,从而导致转化率低下。目前所用的小麦受体仅限制在“Bobwhite”和“Pavn”有限基因型中,而这些品种的农艺性状和品质性状较差。(3)缺乏高效表达载体。目前小麦遗传转化技术,常用的高效表达启动子局限于玉米Ubi-l、CaMV35S等。(4)小麦遗传转化涉及到的基因多数集中在报告基因或标记基因上,转化经济安全的目的基因成功的例子较少。(5)缺乏理想的选择标记基因。目前用于小麦转基因的筛选基因多为抗生素基因,其生物安全性仍是社会对转基因生物争议的焦点。(6)小麦大而复杂的基因组导致的转基因后沉默现象,影响外源基因在受体细胞中的稳定表达。拓宽小麦遗传转化的受体范围,利用适应当地生态环境的小麦品种作为受体是研究的方向之一。近年来小麦育种工作者从小麦主产区的推广品种中筛选到了一些再生能力强、适宜进行转化的小麦品种,如科农199、扬麦158、扬麦12等,并获得一大批转基因小麦材料。研究适宜于不同遗传背景品种外植体的高效再生体系及遗传转化体系是小麦转基因技术突破的关键。加强对小麦遗传转化机理的研究,特别是外源基因在小麦染色体中的整合方式,以及与其他基因的互作效应等,可以有效地控制转基因在某一位点的整合,尽可能的克服转基因后的沉默现象。利用已发布的其他植物全基因组序列,挖掘和克隆