红豆杉细胞培养的研究进展

红豆杉细胞培养的研究进展

子松醇是红杉科的一种二氧化合物。它对大多数种类的癌症，如妊娠、子宫癌和乳腺癌也有很好的疗效。现在，它被用作乳腺癌、卵巢和非小细胞肺癌的共线药物。然而从天然生长的红豆杉树中提取紫杉醇无法满足需求,药源不足已成为限制紫杉在临床中大量应用的瓶颈。植物细胞培养具有不破坏自然资源及不受自然条件限制等优点。目前利用细胞大量培养技术生产紫杉醇的研究已经进入到生物反应器放大阶段,美国一公司现在已经完成4000L的培养技术,正在进行20000L规模的工业放大研究。红豆杉细胞培养工业化生产紫杉醇有望获得突破。1组织损伤的诱导和培养1.1外植体诱导车辆愈伤组织的诱导外植体对于愈伤组织的诱导率、生长状况等具有重要影响。红豆杉属植物愈伤组织的诱导相对比较容易。根、茎叶、树皮、形成层、大配子体、种子胚、假种皮、幼苗胚轴、芽等都可作为外植体诱导出愈伤组织,但不同外植体其愈伤组织的诱导率及愈伤组织生长情况差别很大。茎段的诱导效果较好,而树皮、叶片较差。李伯林等研究了中国红豆杉的不同外植体(茎段、带叶茎段、树皮、完整叶片、叶片上半部、叶片下半部)愈伤组织的诱导情况。结果表明,茎段比离体叶片更易诱导出愈伤组织,带叶茎段外植体比不带叶茎段外植体形成愈伤组织要早些,诱导率也稍高;以树皮作为外植体诱导效果不佳。外植体的愈伤组织诱导率与培养基种类有关。在MS培养基上,东北红豆杉幼叶的诱导率最高,而在B5培养基上,幼茎的诱导率最高。红豆杉树的品种对外植体愈伤组织的诱导率和诱导速度也有影响。云南红豆杉、中国红豆杉、矮紫杉及东北红豆杉的茎段外植体均可诱导出愈伤组织,但以云南红豆杉的诱导率最高,诱导速度也最快,相对而言东北红豆杉较差。外植体采样季节对愈伤组织的诱导有影响。云南红豆杉早春取样的茎段形成愈伤组织的时间要比秋季取样早得多;春、夏季取样的东北红豆杉茎段形成愈伤组织的时间、比率均高于秋季取样,而且形成的愈伤组织颜色较浅。以紫杉醇含量高的外植体作为诱导材料,可获得紫杉醇产量高的细胞系。云南红豆杉和中国红豆杉愈伤组织中紫杉醇含量较高,是获得紫杉醇高产愈伤组织系的外植体的较佳来源。1.2不同培养基中激素、激素对愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响对于红豆杉愈伤组织的诱导与培养,多数报道的适宜培养基为基本的或经改良的B5培养基。然而,也有不同的研究结果报道。以南方红豆杉芽为外植体,最适诱导培养基为MS,对愈伤组织的增殖、驯化和紫杉醇的积累则以B5为最佳。张宗勤等报道,南方红豆杉愈伤组织在TA培养基上生长明显优于B5培养基。Ketchum等通过对3个加拿大红豆杉与两个东北红豆杉细胞系的研究表明,没有一种培养基能适合所有的细胞系。因此,对于来源于不同的红豆杉树种,不同的外植体其最适培养基必须经过实验来选择。培养基中氮源影响红豆杉愈伤组织的生长和紫杉醇的含量。培养基中NO-3浓度高有利于红豆杉愈伤组织的生长,而NH+4浓度高则抑制愈伤组织的生长,但可提高紫杉醇的含量。培养基的pH值是影响红豆杉愈伤组织生长及紫杉醇含量的又一重要因素。对东北红豆杉而言,较高pH值对生长有利,pH值为7.0时愈伤组织生长状态最好,但pH值为6.0时愈伤组织中紫杉醇的含量最高;对南方红豆杉而言,pH值为5.5时对愈伤组织的生长最为有利,pH值为7.0时紫杉醇的含量最高。可见,有利于愈伤组织生长的pH值不同于次生代谢产物合成所需的适宜pH值。紫杉醇的产量取决于生物量的增加和其中紫杉醇的含量两方面的因素,因此,用细胞培养法生产紫杉醇时需综合考虑愈伤组织生长和紫杉醇形成对各种培养条件的不同要求。在培养基中添加适宜浓度的有机物可以提高愈伤组织的诱导率和生长状况。添加10%的椰子汁(CM)可提高外植体愈伤组织的诱导率和生长势,添加10%的椰子汁或0.1%的水解酪蛋白(CA)可使红豆杉的愈伤组织生长得更快,并且可使愈伤组织维持更长时间,其中CM的效果比CA的效果更好。盛长忠等的研究也表明培养基中添加CA能促进南方红豆杉愈伤组织的生长,但高浓度(0.5%)CA不利于紫杉醇的积累,以0.1%为宜,既能促进愈伤组织的生长,又不影响紫杉醇的含量。培养基中激素、激素的浓度及激素之间的组合对愈伤组织的诱导和培养起着重要作用。适宜浓度的NAA、2,4-D、6-BA、赤霉素(GA3)、IAA、IBA、等都可促进红豆杉愈伤组织的诱导和生长,但在效率上存在差异。对中国红豆杉进行的实验表明,添加2.0mg/L的2,4-D较易诱导出愈伤组织,2.0mg/L的NAA也具有较好的诱导效果,IAA单独使用不能使外植体形成愈伤组织;对于愈伤组织的生长而言,4.0mg/L的NAA效果最好,2,4-D的效果次之,IAA的效果最差。江洪如等研究表明,2mg/L的2,4-D的诱导效果优于同样浓度的NAA。盛长忠等也报道对南方红豆杉,2,4-D比NAA更有利于愈伤组织的形成。但也有研究表明,NAA激素组合比2,4-D组合更有利于愈伤组织的诱导,在B5培养基中添加2.0mg/LNAA+1.0mg/LIAA+0.5mg/LKT,东北红豆杉幼茎的愈伤组织诱导率可达100%。产生上述不同结果,可能与红豆杉的品种、培养基的种类及激素之间的组合等因素有关。由于2,4-D具有致癌活性,因此作为药源的红豆杉细胞培养中宜使用其它种类的激素代替。1.3培训条件黑暗条件有利于愈伤组织的诱导、生长和紫杉醇的形成,紫杉醇的产量高于光照条件下的3倍。愈伤组织诱导与培养的适宜温度为20～25℃。1.4采用合适的培养基、培养条件有利于缓减褐变的发生红豆杉属植物愈伤组织的诱导、继代培养过程中,细胞会分泌大量的棕色色素物质,这些色素物质的积累会影响愈伤组织生长,愈伤组织受毒害而逐渐转为暗褐色至黑色,这种现象称为褐变。关于褐变机理,一般认为是木本植物细胞中含有较多的酚类化合物在多酚氧化酶的作用下转变为醌类物质。这些醌类物质逐渐扩散到培养基中并积累起来,抑制了细胞中其它很多种酶的活性,破坏了正常的代谢过程,使生长受到抑制。培养基中提高激素浓度、添加抗氧化剂、添加吸附剂等能有效缓减褐变。夏铭等对控制红豆杉组织培养中的褐变进行了较为系统的研究,发现选择合适的外植体、培养基和培养条件对于防止褐变的发生是至关重要的,处于旺盛生长季节的幼嫩茎段愈伤组织发生率高,增殖快,褐变程度轻;适宜的培养基(MS+ZT0.5mg/L+NAA10.0mg/L+GA32.0mg/L+2%蔗糖)对减轻褐变的伤害是很有利的;初期的暗培养(2周左右)可在一定程度上减轻褐变程度,培养温度不宜过高;此外,抗氧化剂(VC、VE、PVP、硫脲、亚硫酸钠、硫代硫酸钠、过氧化氢、柠檬酸等)、金属离子螯合剂、热激处理和活性炭处理等方法可在一定程度上减轻褐变的程度。他们认为防止褐变应从选择合适的外植体和培养基、培养条件入手,同时综合采用各种方法,从多方面减少褐变的发生或减轻褐变造成的损伤。梅兴国等比较了活性碳(AC)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)对红豆杉细胞褐变的抑制效果,结果表明,AC对褐变的抑制和对生长的促进均优于PVP,且在对数生长期加入效果最佳。2高产紫杉醇系利用红豆杉细胞大规模培养生产紫杉醇的关键之一是需要有高产、稳定的细胞克隆系。愈伤组织中紫杉醇含量不单纯取决于外植体的来源,可能更重要的是高产细胞株系的筛选。在红豆杉高产细胞系筛选方面近年来取得了很大的进展,一些筛选出的高产系紫杉醇含量达到了细胞干重的0.1%～0.3%。罗建平等利用根癌农杆菌T-DNA对红豆杉原生质体转化并实现插入诱变,获得的高产转化系细胞在继代培养中的生长和紫杉醇积累基本稳定,为分离高产紫杉醇细胞系提供了新的单细胞筛选系统。梅兴国等通过胁迫法筛选出抗苯丙氨酸的红豆杉细胞变异系,其紫杉醇含量高于原型细胞系3～5倍。3培训方法3.1细胞培养的方式和愈伤组织相比,悬浮培养的细胞与液体培养基充分接触,养分供给充分,因而细胞生长周期短,细胞生物量增加快,是植物细胞培养主要的方式。迄今已有关于红豆杉属植物细胞悬浮培养生产紫杉醇的多个专利和公开报道,对悬浮培养的培养基、激素、培养条件、接种量、代谢调控、生物反应器类型等多方面的内容进行了研究。培养规模现已达到中试水平,紫杉醇产量也有了很大提高,Yukimune等获得了300mg/L(细胞干重的0.6%)的高产量,显示出良好的工业化生产前景。3.2用纤维素固定东北红豆细胞固定化培养具有可连续培养、反应效率高、易于调控等优点,成为植物细胞培养研究中的一个重要方法。Fett-Neto等用玻璃纤维固定东北红豆杉细胞,可连续培养6个月,紫杉醇产量可达细胞干重的0.012%。Xu等采用固定化培养技术培养东北红豆杉细胞,发酵液中紫杉醇产量达到4.9mg/L,是自由悬浮培养的5倍。3.3实现细胞连续培养和分离提取两相培养技术能够使产物及时转入第二相,可以防止反馈抑制或被细胞内部的分解酶将产物降解,从而提高产物的产量;通过有机相的不断回收及循环使用,有可能实现细胞的连续培养,提高培养效率。而且,产物在第二相中富集,便于后续的分离提取。两相法培养的关键技术之一是选择适当的第二相,要求其既具有良好的生物适合性,又对紫杉醇有高的溶解度。红豆杉细胞培养中适合的有机溶剂有油酸、邻苯二甲酸二丁酯等。Wu等对红豆杉细胞进行超声波处理和茉莉酸甲酯诱导后用邻苯二甲酸二丁酯作为有机溶剂进行两相培养,紫杉醇产量高出对照组17倍。3.4合成甲基工程细胞的快速生长与紫杉醇的大量合成并不同步进行,而且,这两过程对培养条件的要求也不一致。因此,把红豆杉细胞培养过程分为细胞生长和红豆杉合成两个阶段,可望解决上述矛盾。Bringi等通过两步培养并延长培养时间,又结合优化培养基、添加诱导子等综合措施,使中国红豆杉细胞培养的紫杉醇产量达到153mg/L,此法已获得专利。Choi等针对红豆杉细胞生长和合成紫杉醇的适宜温度不同,在细胞生长期采用24℃培养,在后期采用29℃培养,显著提高了紫杉醇的产量,达到137.5mg/L。4生物反应器中紫杉醇的发酵在悬浮培养中,植物细胞比微生物细胞对培养液的剪切力更敏感,因此开发适合植物细胞培养的新型生物反应器是进入工业化生产的必要前提之一。钟建江等开发了一种新型离心浆搅拌式生物反应器,具有剪切力小的特点。中国红豆杉悬浮细胞在离心搅拌浆和常规搅拌浆两种不同反应器中虽然两者的细胞比生长速度大致相同,但在常规搅拌浆反应器中,细胞延迟期较长,且细胞严重附于反应器上,不利于培养,而离心搅拌浆则无此缺点。红豆杉细胞在气升式反应器中培养鲜重的倍增时间为7.68d,比在机械搅拌式反应器中的倍增时间8.15d要短,并且紫杉醇的积累也较高,而且气升式反应器剪切力较小,气体传递良好,因此气升式反应器比搅拌式反应器更适合于红豆杉细胞培养。Son等研制了一种气球型气泡式生物反应器(Balloon-typebubblebioreactor,BTBB),并与其它几种不同类型的生物反应器进行了比较研究,结果表明BTBB最适合红豆杉细胞培养,在500L的反应器中,紫杉醇的产量达到3mg/L。细胞培养动力学研究能提供细胞生长、营养物质利用、产物积累状况等相关信息,对于培养过程控制,优化与放大比不可少。Srinvasan等对250ml锥形烧瓶、1L气动混合反应器(PMB)与1L搅拌桶式反应器(STB)等3种型号生物反应器中欧洲红豆杉细胞悬浮液中的生物量积累、营养素吸收和紫杉醇产量的动力学进行了研究。结果表明,PMB培养的细胞中紫杉醇含量达到了1.5mg/L,摇瓶中为0.3mg/L,而STB中仅为0.1mg/L,但产生紫杉醇的相关动力学在3种反应器中相同,表明欧洲红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇适合于按比例扩大。不同品种的红豆杉细胞其培养动力学存在明显不同。东北红豆杉悬浮细胞生长缓,鲜重和干重的倍增时间分别是17d和20d,细胞中紫杉醇的含量与细胞的生长不呈相关性,在一个生长周期(40d)中,培养基中的紫杉醇含量有2个高峰;一个在培养初期(0.4μg/ml,另一个在生长末期(0.1μg/ml)。中国红豆杉悬浮细胞生长较快,倍增时间干重为5.4d,湿重为9d,紫杉醇在延迟期(从6d开始)出现积累,在对数生长期逐步增加,在静止期(第24d)达到最大,紫杉醇积累量与细胞生长属于部分相关型。诱导子影响红豆杉细胞悬浮培养过程中的动力学行为,改变紫杉烷类化合物合成的时间进程。目前,虽然红豆