利用叶盘转化法获得遗传转基因植物

利用叶盘转化法获得遗传转基因植物

由于牧草的简单培养性和高基因转化效率，牧草已成为植物育种和生物学研究的重要模式。自从Horsh等首次获得烟草转基因植株以来,以烟草为材料的转基因技术为基因功能分析提供了有效途径,同时使植物遗传转化的研究和应用得到飞速发展。在植物基因工程中,目前研究最清楚、应用最广泛的外源基因转化方法是根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的遗传转化技术,在已获得的近200种转基因植物中约有80%是由农杆菌介导完成的。因方法简单、效率高、拷贝数少等优点,它已成为目前主要的转基因技术。建立快速、高效、简便的植株遗传转化体系对快速获得转基因植株至关重要。其中,外植体的选择及其特定的生理状态、抗生素的筛选、农杆菌浸染浓度、浸染时间、外植体的暗培养时间等是植株遗传转化体系中的关键因素。本研究以普通烟草品种中烟100为外植体,通过农杆菌介导的叶圆盘法对烟草进行遗传转化,探索农杆菌介导的遗传转化条件及其影响因素,建立农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系,为目的基因功能的研究提供较好的基础。1材料和方法1.1试验材料1.1.1种子处理和吸干以烟草品种中烟100为试验材料,种子浸于体积分数75%乙醇中30s,用无菌水冲洗,然后浸于0.1%氯化汞中4min,滤出种子,再以无菌水清洗3～5次,用滤纸吸干。将消过毒的种子接种于播种培养基(1/2MS)中,于26℃光照条件下培养,得到烟草无菌苗叶片。1.1.2质粒筛选和转化转化受体菌为根癌农杆菌EHA105,载体为pBI121,含卡那霉素筛选抗性基因以及目的基因,利用液氮直接转化法将质粒转入农杆菌中。1.2测试方法1.2.1外植体的筛选将共培养后的外植体用无菌水冲洗4～5次,用滤纸吸干表面水分,再分别转到附加不同质量浓度(100、200、300、400、500、600mg/L)的头孢筛选分化培养基上进行培养。每处理30个外植体,3组重复。统计外植体污染率和抗性芽分化率,从而确定最合适的抗生素浓度。1.2.2烟叶片浸染组选取30、50、80、120d的烟草叶片,避开边缘及主脉用打孔器打成圆盘状,再分别浸入农杆菌菌液中进行浸染,同时设置未浸染叶片为对照。1.2.3确定卡那霉素的筛选浓度将无菌烟草叶盘分别接种到含卡那霉素0、20、40、60、80、100mg/L的MS1培养基上,每处理接种30个外植体,3组重复,培养3～4周后统计外植体出芽率,从而确定卡那霉素的筛选浓度。1.2.4不同浸染时间对叶片的影响将烟草叶盘分4组,每组30个外植体,设3组重复。置于活化的农杆菌(D600nm为0.6)悬浮液中浸泡,间歇摇动,使叶片与菌液充分接触,4组浸染时间分别为3、6、9、12min。浸染完毕后取出叶盘,用无菌滤纸吸干表面菌液,转入MS1分化培养基中,暗培养2d,再转入MS2培养基中进行筛选培养。1.2.5外植体的筛选将侵入后的烟草叶盘转入MS1分化培养基中,分别暗培养1、2、3、4d,然后转入MS2培养基中进行筛选培养。每处理30个外植体,3组重复。统计外植体抗性芽分化率,从而确定共培养时间。1.2.6pcr对转移植物的鉴定和rt-pcr(1)低温种植叶片dna采用CTAB法提取MS3培养基中生根的转基因植株和野生型烟草植株幼嫩叶片DNA。以转基因植株的DNA为模板,以含有目的基因片段的质粒为阳性对照,以野生型植株作阴性对照,进行PCR扩增鉴定。(2)目的基因转录水平的rt-pcr检测用Trizol法提取MS3培养基中生根的转基因苗和野生型烟草幼嫩叶片的总RNA,并反转录成cDNA,以目的基因的特异引物RT-PCR分析目的基因转录水平的表达情况。2结果与分析2.1抗生素浓度对抗性芽分化率的影响由图1统计得出,抗生素浓度对外植体分化具有明显的影响。当培养基中加入头孢霉素的浓度为400mg/L时,抗性芽的分化率最高,达到31.1%;当抗生素浓度过低而无法抑制农杆菌的生长时,外植体污染导致死亡;当抗生素浓度过高时,虽能有效抑制农杆菌的生长,但是外植体严重白化,抗性芽的分化率低于10%。因此,抗生素的浓度定为400mg/L。2.2烟草叶片芽分化时间的影响30日龄的烟草刚长出4～5片小叶片,由于叶盘太幼嫩,在农杆菌溶液中浸染容易染菌死亡;80日龄、120日龄的烟草叶片已经变成深绿色,叶片比较大,虽然在后期浸染过程中抗菌能力较强,但是浸染效果差,影响转化效率;对照组中4个叶龄的叶片芽分化时间基本一样。所以,在外植体的选择上应尽量选取50d左右的烟草叶片。2.3卡那霉素对烟草外植体的诱导诱导分化在烟草转化体系中,叶盘的分化能力可长达30d左右,每块叶盘上分化的再生芽较多,对后期假阳性删除难度增大。因此,该试验在分化培养基中加入不同浓度的卡那霉素来确定适宜的选择压浓度,以便在早期获得较高频率的阳性植株。试验结果(表1)表明,将未经转化的烟草外植体放在加有不同卡那霉素浓度的分化培养基上,分化受到不同程度的抑制。在0～60mg/L卡那霉素的培养基上能正常长出愈伤,分化出芽;浓度大于60mg/L的卡那霉素,分化受到不同程度的抑制;在100mg/L卡那霉素的培养基中,叶片不能形成愈伤分化芽,逐渐发白死亡。因此,本试验选用100mg/L卡那霉素的培养基作为外植体的卡那霉素筛选浓度。2.4农杆菌受教育作用由图2看出,农杆菌浸染时间对转化效率的影响很大。农杆菌浸染时间过短,农杆菌无法有效附着,降低了共培养时农杆菌的侵入,转化效率降低;农杆菌浸染时间过长,外植体受到农杆菌伤害程度增大,抗性芽分化率较低。所以,浸染外植体菌液的D600nm为0.6时,浸染时间确定为6min。2.5外植体污染率随着共培养时间延长,外植体的污染率也逐渐增大。当共培养1d时,抗性分化率只有12.6%,外植体污染率也最低;当共培养2～3d时,抗性芽分化率最高为31%,农杆菌也能得到控制;而将共培养时间延长到4d以上时,农杆菌生长旺盛,除菌不彻底,致使抗性芽的分化率明显下降。外植体与农杆菌的适宜共培养时间确定为2～3d。2.6rt-pcr检测基因表达由图3可以看出,部分转基因植株DNA扩增出与质粒DNA扩增产物相同的特异性条带,而阴性对照植株没有扩增出特异性条带。由于常规PCR检测结果通常仅作为转基因植物初选的依据,这只是在整合水平上进行的检测,有必要通过RT-PCR检测,在转录水平上为阳性的植株作进一步验证。由图4可知,在被检测的PCR阳性苗中,经RT-PCR扩增均能产生与基因片段大小一致的特异电泳带,而阴性苗无相应的条带出现。说明被测转基因苗的目的基因均表达产生了mRNA。[TPZL3.tif,BP][TPZL4.tif,BP][ΤΡΖL3.tif,BΡ][ΤΡΖL4.tif,BΡ]3外植体的选择和抗生素的用量植物的遗传转化受到多种因素的影响,要想建立一个高效的农杆菌介导植物转化系统,就必须对影响遗传转化的多因素进行全面探索与优化。在农杆菌介导植物遗传转化体系的建立过程中,在转化初期有效地筛选被转化的细胞和抑制农杆菌的生长对转化成功与否非常重要。在植物遗传转化中使用的选择性标记基因有很多种,卡那霉素抗性基因是植物转化中所用的第1个也是目前最常用的标记基因。但是不同品种的烟草对农杆菌的浸染具有不同的敏感性,因此,确定受体植物合适的卡那霉素筛选浓度是十分必要的。本研究结果表明,卡那霉素浓度升至100mg/L时,中烟100的出愈率达到6.7%,大部分叶盘逐渐白化,继而死亡,故适宜浓度为100mg/L。外植体的选择对转化效率也有一定的影响,叶盘应尽量取自幼嫩、健壮的叶片,这样既易于诱导丛生芽,也不会由于多次操作和农杆菌浸染而死亡,这与白林涵等的研究结果一致。本试验选取不同生长时间的烟草叶片作比较旨在确定最适合浸染的时期,30日龄的烟草叶片虽然再生能力较强,但是对农杆菌的耐受能力太差,所以50日龄的烟草叶片最适合用于转化。植物材料受到农杆菌浸染后须用抗生素及时、有效地杀死或抑制细菌,以防止细菌危害组织并影响植株再生;但同时向培养基中加入抗生素也会影响植物组织的正常生长和分化,所以,确定合适的抗生素使用量对提高遗传转化效率具有重要意义。在本试验