组织培养结合秋水仙碱诱导植物多倍体的研究进展

组织培养结合秋水仙碱诱导植物多倍体的研究进展

该技术是在传统的化学诱导基础上发展起来的，并随着植物组织培养技术的发展而成熟。目前该项技术在国内外被育种学家广泛用于培育多倍体，以求达到改良植物品种和丰富种质资源的目的。1优势和劣势1.1组织培养、诱导培育植物多倍体的传统诱导法是以植株生长点、叶芽或种子等为诱导对象，由多细胞构成的芽发育成植株，因细胞分裂不同步，容易形成嵌合体，难于获得同质的多倍体，诱导率也较低。随着生物技术的发展，通过对材料进行组织培养然后再作诱导处理，能使诱导加倍的多倍体单细胞分化出不定芽，并发育成单株，形成同质多倍体，提高诱导率，有效排除嵌合体的干扰，并且缩短多倍体培育时间。曾宪松等用0.5%秋水仙碱处理橡胶树(Heveabrasiliensis)二倍体花药体细胞愈伤组织1d，可有效地从多倍性的细胞再分化成多倍性胚状体，并再生为纯合的四倍体植株，克服了常规诱导法造成的嵌合体现象及其所存在的多种弊端，且大大缩短了培育纯合四倍体的时间。1.2养结合秋水仙碱诱导培育植物的培养模式常规的多倍体诱导试验常在室外进行，室外的温度、光照等试验条件难于控制，而组织培养结合秋水仙碱诱导培育植物多倍体是在室内进行，室内试验条件容易控制，且易于重复试验结果，提高工作效率。目前随着组织培养技术的发展与成熟，越来越多植物的快繁体系已被建立，这也为利用组织培养与秋水仙碱诱导相结合培育植物多倍体提供了良好的基础。2仙碱对外植体的作用较常用的诱导方法有滴液法、浸渍法、混培法。由于秋水仙碱对外植体有一定的伤害作用，因而有学者认为，在暗条件或弱光条件下诱导可减轻对外植体的伤害，同时处理后的外植体在这种条件下培养一段时间可起到恢复的效果。2.1外植体的诱导用无菌的脱脂棉包裹外植体，滴加药液，保持棉花湿润，药液浓度一般为0.1%～0.5%，处理时间一般为1～3d，常在药液中加入2%～3%的二甲基亚砜（DMSO）提高诱导率；处理完毕后充分清洗外植体，再接入新鲜的培养基中培养。周朴华等在弱光条件下用浸有0.02%～0.05%秋水仙碱的棉花包裹黄花菜(Hemerocalliscitrina)的愈伤组织24h后，反复水洗，再转入芽分化培养基中，获得同源四倍体黄花菜，同时发现药液中加入2%DMSO，诱导变异的频率可提高10%左右。2.2外植体的处理秋水仙碱常用的浓度为0.1%～1%，具体浓度视植物对秋水仙碱的敏感程度而定。操作方法是将外植体浸渍在已过滤无菌的秋水仙碱溶液中，处理时间一般是2h至2d，处理完毕后充分清洗外植体，再接入新鲜的培养基中培养。张兴翠等将芦荟(Aole)的丛生芽浸入0.02%～1%秋水仙碱溶液中浸渍24h，充分水洗后转入分化培养基中，培养40～60d得到纯合的四倍体。有学者认为在振荡条件下浸渍外植体诱导效果更好。郭启高等将剥去芽鞘的姜(Zingiberofficinale)芽浸泡于0.05%～0.4%的秋水仙碱溶液中，150r/min振荡48h，清洗后转入分化培养基中培养，能够获得较高的诱导率。2.3不同的诱导方法直接在培养基中加入无菌的药液，药液的浓度不宜太高，一般为10～300mg/L，外植体处理时间为几天至一个月，处理完毕后直接转入新鲜培养基中，不用清洗外植体。郭启高等将秋水仙碱灭菌后按5、10、20、30和40mg/L的浓度分别加入姜的分化培养基中，然后接入剥去芽鞘的姜芽，处理5或10d后再转到不含药液的新鲜培养基中，获得四倍体姜的植株。上述诱导方法各有长短，浸渍法省药、省工，并且药液还可以回收利用；滴液法、混培法耗药、费时。对于不同植物，不同的诱导方法有着不同的诱导效果。陈柏君在诱导黄岑(Scutellariabaicalensis)多倍体时发现浸渍法优于混培法，而周嘉裕等在诱导辣椒(Capsicumannuum)多倍体时认为混培法优于浸渍法。3浓度和时间组合对诱导的影响经秋水仙碱处理的外植体前期生长缓慢，这是由于秋水仙碱对外植体细胞的毒害作用所致。这种毒害作用随着处理浓度的增加或时间的延长而加剧，从而使外植体死亡率增加，因此，要掌握合适的处理浓度和时间才能获得最好的加倍效果。在离体材料的诱导中，秋水仙碱浓度高，处理时间长，导致材料死亡率高，但多倍体诱变率并不一定提高；而浓度低，处理时间短，则不易得到加倍的植株；只有较佳的处理浓度和时间的组合才能获得较高的诱导率，如在苎麻、苹果等植物离体组织的多倍体诱导。但也有人认为，用高浓度的秋水仙碱进行短时间处理效果较好，如张俊莲对当归的愈伤组织进行诱导时发现最佳处理为高秋水仙碱浓度与较短的时间相结合。不同植物的离体材料对秋水仙碱的敏感程度有较大差异，有些对秋水仙碱极其敏感，故只能用较低的浓度进行，处理时间也相对短些，如诱导库拉索芦荟多倍体时，用0.06%秋水仙碱浸泡丛生芽12h后，诱变频率达50%；有些植物的离体材料对秋水仙碱不太敏感，则可用较高的秋水仙碱浓度进行诱导，处理时间也相对长些，如巴西橡胶树在多倍体诱导中，用0.5%秋水仙碱浸泡花药愈伤组织1d，能得到最高的诱变率。处理温度对秋水仙碱的作用有一定影响，过高或过低的温度均不利于多倍体细胞的发生。一般认为最适合的温度为15℃左右，同时综合药液浓度与处理时间考虑，认为温度低时药液浓度可稍大，处理时间可稍长些，温度高时则降低药液浓度，缩短处理时间。4选取的诱导材料由于秋水仙碱只能影响正在分裂的细胞，对处于静止状态的细胞不起作用，因此，选取的诱导材料原则上必须是幼嫩、分化力较强的组织。目前报道最多是用愈伤组织和丛生芽作为诱导材料，也有个别报道用种子、茎段、离体植株的组织。4.1细胞再分化培养用秋水仙碱处理植物的愈伤组织时，体细胞较容易加倍，加倍的体细胞再分化成植株，这样较易获得纯合的四倍体植株。目前很多采用愈伤组织作为诱导材料，也取得较好的效果，如黄锦秀等用0.15～0.2%秋水仙碱处理枸杞愈伤组织，获得同源四倍体枸杞。4.2附加四倍体丛生芽比较幼嫩，是最常用的诱导材料，经秋水仙碱处理后有部分体细胞会加倍，由于丛生芽的分化力比较强，加倍后的体细胞较易分化成植株，这样也比较容易获得纯合的四倍体植株。如郑思乡等用0.1%秋水仙碱处理苎麻(Boehmerianivea)的丛生芽，获得94%四倍体植株。4.3多倍体再生植株秋水仙碱处理种子后，种子的部分体细胞已加倍，该种子的胚轴、子叶诱导成的愈伤组织也有部分体细胞是加倍，由此可分化成多倍体再生植株。如陈素萍等将党参(Codonopsispilosula)种子播种于含一定浓度秋水仙碱的培养基中发芽，尔后进行胚轴的组织培养，获得了四倍体变异植株。种子作为诱导材料要经过愈伤组织阶段，而如果直接用秋水仙碱处理愈伤组织，其诱导率会更高，操作更方便，也更易获得纯合多倍体植株。因此，目前较少用秋水仙碱处理种子后再结合组织培养来培育多倍体。4.4多倍体植株的发育离体植株的组织比较幼嫩，分化力也较强，经秋水仙碱处理后体细胞易于加倍，加倍的体细胞发育成的植株为多倍体植株。如刘庆忠等用皇家嘎拉苹果的离体新梢叶片作为诱导材料，叶片外植体在含有0～200mg/L秋水仙碱的液体再生培养基中培养5d后，再转移到不含有秋水仙碱的再生培养基中培养，获得四倍体植株。4.5．诱导材料的选择采用茎段作为诱导材料诱导率较低，嵌合现象较严重，如韩礼星等用半木质化半剥皮的猕猴桃(Actinidchinensis)茎段作诱导材料，接入含100～500mg/L秋水仙碱的分化培养基中培养30d，获得的多倍体植株都是嵌合体。上述五种诱导材料，诱导效果较好的是愈伤组织和丛生芽，其次为种子和离体植株的组织，较差的是茎段。但是诱导材料的选取与植物组织培养的过程密切相关，如芦荟的组织培养过程是由茎尖直接分化丛生芽，则选取诱导芦荟多倍体的诱导材料只能是丛生芽；黄岑的组织培养过程是种子茎段—愈伤组织—丛生芽，可选取愈伤组织或丛生芽作诱导材料。不同的诱导材料对诱导的效果也有所不同，如吴清在金荞麦(Fagopyrumcymosum)的离体快繁结合秋水仙碱诱导同源四倍体的试验中，分别选用无菌芽和愈伤组织作为诱导材料，结果发现在相同的处理条件下愈伤组织的诱导率、存活率都明显高于前者。因此，在组织培养结合秋水仙碱诱导培育植物多倍体的过程中，应注意选取合适的诱导材料。5木本植物种间生长状况的差异组织培养与秋水仙碱诱导相结合培育植物多倍体，可在短期内对那些有价值的多倍体材料进行大量的增殖，并能进一步发挥组织培养的优势进行工厂化生产，以满足市场需求，因此，有着很好的应用前景。通过组织培养与秋水仙碱诱导相结合的技术途径成功培育植物多倍体的报道有草本植物的睡莲(Nelumbonucifera)、芋类(Xanthosomasagittifolium)、姜类、黄花菜、黄瓜(Cucumissativus)、白菜(Brassicacampestris)、莴苣(Lactucasativa)、马铃薯(Solanumtuberosum)、辣椒、重瓣大岩桐(Sinningiaspeciosa)、百合(Liliumdavidii)、苎麻、芦荟等；木本植物的茶属(Camellia)、苹果、猕猴桃、柿(Diospyroskaki)、桑树(Morusalba)、巴西橡胶树等。总体而言，草本植物较多，木本植物较少，主要原因是由于草本植物离体微繁体系建立比较容易，也较成熟；而木本植物除了杨树、桉