双水相分配与超声提取集成法提取分离连钱草总黄酮的工艺研究

双水相分配与超声提取集成法提取分离连钱草总黄酮的工艺研究

连草是嘴唇科植物的活血丹。它具有润湿、解毒、散瘀、止血的作用。临床上可用于治疗热淋、石淋、湿热黄疸等疾病。在我国,连钱草资源十分丰富。连钱草含有黄酮类、三萜类、挥发油以及无机盐等化学成分。其中,黄酮类成分主要含有芹菜素、木犀草素等。目前,已有文献报道采用超声提取法、回流提取法和超声循环法提取连钱草中黄酮类成分。其中,超声提取是利用超声波的“空穴作用”产生的冲击波和射流破坏植物细胞和细胞膜结构,使黄酮化合物的释放和溶出过程温度较低,可有效保持生物活性。双水相分配技术是基于液-液萃取原理,同时保持生物活性所开发的一种新型萃取分离技术。具有分离条件温和、操作简单、可调节、易保持分离物生物活性、易与其他技术集成等特点。传统的双水相分配技术因使用黏度较大的聚合物,具有成本高、后续处理难等缺点。改良后,采用低级醇-盐双水相体系克服了上述缺点,应用领域十分广阔。笔者将丙醇-硫酸铵双水相分配技术与超声提取技术集成,实现提取与分离一体化,研究连钱草总黄酮的提取与分离,为连钱草的进一步开发提供理论依据。1材料表面1.1仪器751-GW型分光光度计(上海分析仪器厂);CQ250型超声波清洗仪(上海超声波仪器厂);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。1.2药品、制剂连钱草(笔者采集)经云浮市药品检验所鉴定为真品,粉碎,过80目筛;芦丁对照品(中国药品生物制品检定所,批号:008-9705);所用试剂均为分析纯。2方法和结果2.1丙醇及成相盐用量对双水相的影响低级醇-盐双水相体系参考文献,其中水溶性有机溶剂选择丙醇,成相盐选择(NH4)2SO4,通过改变丙醇与水的比例及(NH4)2SO4的用量可以控制双水相的形成。2.2总黄酮含量的测定准确称取连钱草粉末5.0g,置于250mL具塞锥形瓶中,加入一定量的丙醇和水,浸泡1h,再加入一定量的(NH4)2SO4成相,超声提取一定时间,过滤,滤液于分液漏斗中静置分层,上层以丙醇减压浓缩,用60%乙醇定容至100mL,此溶液为总黄酮提取液,测定总黄酮含量,计算总黄酮得率。2.3黄酮的总含量2.3.1标准曲线及线性回归法参考文献精密称取120℃常压干燥至恒重的芦丁对照品21.62mg,置于具塞锥形瓶中,加60%乙醇60mL,密塞,超声使其溶解,放冷,加60%乙醇至刻度,摇匀,得芦丁对照品溶液(0.2162mg·mL-1)。精密量取芦丁对照溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL,分别置于25mL的容量瓶中,分别加水6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0mL,加5%亚硝酸钠溶液1mL,摇匀,放置6min,再加5%氢氧化钠溶液10mL,加水至刻度,摇匀,以第一管作空白对照,在510nm波长处测吸光度。以对照品浓度(Y)为纵坐标,吸光度(X)为横坐标,进行线性回归,得回归方程为Y=0.0862X-0.0000489(r=0.9990)。结果表明,总黄酮在0~0.05mg·mL-1浓度范围内与吸光度呈良好线性关系。2.3.2样品的重量测量2.4最佳工艺条件的确定2.4.1超声时间、料液比对总黄酮提取率的影响分别考察超声提取时间、丙醇体积分数、料液比及(NH4)2SO4浓度对总黄酮提取率的影响。结果表明,不加超声时,总黄酮提取率很低,随着超声时间的增加总黄酮提取率升高,在20~30min内增加较快,当超声时间超过40min后,提取率开始降低;总黄酮提取率随提取溶剂比例的增大而升高,在料液比为1∶10~1∶25时,总黄酮提取率增加较快,当料液比超过1∶30后,总黄酮提取率开始降低,同时料液比的增加导致溶剂用量加大,即增加成本,又给后续处理带来麻烦;总黄酮提取率随丙醇体积分数的增大而增高,在丙醇体积分数为30%~50%时,总黄酮提取率增加较快,大于60%后,提取率开始降低;(NH4)2SO4浓度在15%~35%之间,总黄酮提取率随着(NH4)2SO4浓度增加而增高,45%后开始降低。2.5测试测试在正交试验选取的最佳工艺提取条件下,进行3次验证试验,总黄酮平均得率为5.04%。2.6提取方法比较准确称取药材粗粉5.0g,采用有机溶剂回流提取法、超声提取法与双水相分离与超声提取耦合集成进行比较。其中回流提取法:取药材粉末,第1次加12倍量60%乙醇回流40min,第2、3次分别加10倍量60%乙醇回流30min;超声提取法,即药材粗粉加120倍量的60%乙醇,超声提取50min。提取结束时测定溶液温度。分别回收溶剂,减压干燥,得总黄酮提取物,称量后称取部分以乙醇溶解,用60%乙醇配制成待测溶液,计算提取物中总黄酮含量。不同提取方法比较结果见表4。由表4可知,3种方法总黄酮提取率相近,在5.01%~5.09%之间(P>0.05),但本法提取时间30min,低于回流提取法100min和超声提取法50min(P<0.01),表明效率高;本法提取温度37.2℃,低于回流提取法78℃,表明条件温和;本法提取物黄酮含量21.05%,高于回流提取法11.96%和超声提取法12.01(P<0.01),表明粗提物纯,产品质量高。3超声-丙醇-硫酸铵双水相体系丙醇能与水无限混溶,但加入一定量的无机盐可形成稳定的双水相体系,双水相形成是硫酸铵与丙醇争夺水分子的过程,随着硫酸铵的用量增加,其对水分子的束缚能力增强,丙醇从盐水相中析出,而水分子也离开丙醇相,结果,丙醇相对浓度增加,对黄酮的萃取能力增强,黄酮的提取率提高。无机盐用量与丙醇体积分数有关,丙醇体积分数越大,所需无机盐量越小。黄酮具有较好的醇溶性,在丙醇-硫酸铵双水相体系分配于丙醇相,其它水溶性成分则分配于盐水相中。在本法提取过程中,在超声波的作用下,黄酮和其它水溶性物质同时分别从植物细胞中进入丙醇相和盐水相,从而在提取同时实现黄酮与其它无效水溶性物质的分离,提高了产物纯度。同时,由于黄酮向丙醇相的转移,改变了提取过程中的化学平衡,有利于黄酮的溶出。本研究表明,双水相分配与超声提取集成化提取连钱草总黄酮和传统方法相比,所得总黄酮得率相近,但所需时间短,提取效率高;所需温度低,有利于热敏物质的提取分离;由于提取分离同时进行,操作简便;所得粗提物纯度高,有利于提取物后续加工处理。总之,本法操作简便、条件温和、效率高,具有很大优势。精密量取样品提取液1.0mL,然后按“2.3.1”项下方法测定总黄酮含量,计算总黄酮提取率。由表2、表3可知,各因素对总黄酮得率影响程度依次为B>A>D>C,即丙醇体积分数>超声时间>(NH4)2SO4浓度>料液比。丙醇体积分数、超声时间、(NH4)2SO4浓度对总黄酮得率都具有显著的影响,最终确定的连钱草最佳提取条件为B1A1D2C1,即丙醇体积分数为50%,超声时间为30min,