烟草黑胫病防治内生细菌防治试验

烟草黑胫病防治内生细菌防治试验

黑胫骨草是草科病的重要疾病之一，可从苗期到高产期产生。生产上主要以化学防治为主,但化学防治易造成环境污染,而且药剂难以长期持续有效,所以探索生物防治途径,研发生防产品对烟草病害的防治显得尤为重要。利用有益微生物防治植物病害有效期长、保护环境,是近年来研究的热点,植物内生细菌分布于植株体内,生长繁殖相对稳定,是很好的生防菌资源,有些内生细菌还有促生作用。内生细菌用于植物病害的生物防治在水稻、棉花、玉米、蔬菜上已有报道,但在烟草上报道较少。烟草上主要是利用从根际分离的真菌、细菌来生物防治烟草黑胫病,但由于从根际分离的真菌、细菌定殖差,受环境条件制约,防效难以稳定,植物内生细菌能够克服以往从PGPR(根围促生细菌)中筛选生防菌的定殖差、受环境影响大的缺点。因此,进行了利用烟草内生细菌防治烟草黑胫病的研究。1菌株来源菌由健康烟株供试品种K326,由云南省烟草科学研究院提供。供试菌种烟草疫霉菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)由典型黑胫病烟株(采自重庆市綦江县)分离得到,内生细菌由健康烟株(采自四川省开江县、重庆市綦江县)的根、茎、叶中分离得到。抗菌谱测定菌株:小麦纹枯病病菌(Rhizoctoniacerealis)、茄褐纹病病菌(Phomopsisvexans)、棉花立枯病病菌(Rhizoctoniasolani)、烟草灰霉病病菌(Botrytiscicerea)、烟草炭疽病病菌(Collectotrichumnicotianae)、玉米小斑病病菌(Bipolarismaydis)、烟草赤星病病菌(Alternariaalternata)、棉花黄萎病病菌(Verticilliumdahliae)均由西南农业大学植物生态病理研究所提供。2测试方法2.1细胞培养塑料样品将烟草种子于28℃水中浸泡1d后,放在铺有湿润滤纸的培养皿中于28℃温度下催芽,3d后播于装有湿润细土的瓷盘里,上面再覆一层细沙,于20～26℃温室中光照培养,20d后移栽于装有沙壤土的塑料钵中,每钵1株,塑料钵的体积为0.21dm3,每10d加入1次Hoagland营养液,10mL/钵。烟苗培养至4～6叶期待用。2.2致病性力测定采用髓部碟片法分离烟草疫霉,并作致病性测定和保存菌种,每6个月回接烟草1次,以恢复致病力。从健壮烟草的根、茎、叶中分离内生细菌,得到纯菌株,转管保存待用。2.3烟草疫霉内生细菌抑菌带检测初步筛选:用平板对峙培养法,在芝麻培养基平板上作对峙实验,平板中心接种烟草疫霉,菌块直径0.4cm,周围对称接种待测内生细菌4个菌株,距菌块中心2.5cm,每个菌株重复3次,3d后观察有无抑菌带出现并记录。对有抑菌作用的菌株在芝麻蛋白胨培养基平板上做再次筛选。2.4温室疾病控制2.4.1d的制备将活化的待测菌接种于100mLNA培养液中,在28℃温度条件下,120rpm振荡培养3d,稀释至浓度为1×108cfu/mL,每次施用10mL/株,灌根。2.4.2kno3溶液刮取芝麻培养基上培养14d的菌丝,加入0.1%KNO3溶液浸润,产孢后加无菌水捣碎,调整孢子囊浓度为1×104个/mL,8℃条件下放置20min,稀释10倍后,加入1%的葡萄糖,接种待用。2.4.3烟苗温控疾病试验2.4.3.烟草疫霉的接种选择平板抑菌效果较好的菌株进行温室盆栽控病试验。烟苗移栽时和接种病原菌前18d分别施1次待测菌,方法同2.4.1,以清水为对照,每处理3次重复,每重复12株,烟草疫霉接种为灌根接种,接种前用少量清水湿润土壤,每株用10mL接种菌液灌根。20℃黑暗处理24h,再在28℃、相对湿度80%～90%、光照(日光灯,4500LX,16h/d)条件下培养。7d后调查病情,0级为不发病,1级为植株死亡。2.4.3.菌株的施肥和接种对控病效果较好的菌株进行3种施菌方式下的控病试验。Ⅰ、移栽时施1次待测菌;Ⅱ、移栽时施1次待测菌,接种病原菌前18d、7d各施1次待测菌;Ⅲ、移栽时施1次待测菌,接种病原菌前18d、1d各施1次待测菌,待测菌的施用方法见2.4.1节。对照施用等量清水,烟草疫霉接种为灌根接种,方法见2.4.3.1。每种施菌方式设3次重复,每重复12株。2.5活化菌株的培养采用平板对峙培养法,在PDA平板中心接种活化的待测菌,两边相距中心2.5cm处分别划线接种控病效果较好的活化菌株,设3次重复。28℃培养4d后,测定抑菌带的宽度。2.6识别菌株和其他疾病对防效较好的菌株按文献介绍的方法进行鉴定。3结果与分析3.1内生细菌菌株通过分离、培养、纯化、转管、保存,从烟草根、茎、叶中共获得238个内生细菌菌株。其中从根部分离到138个内生细菌菌株,从茎部分离到75个内生细菌菌株,从叶部分离到25个内生细菌菌株。3.2烟草疫霉菌的抗菌活性从分离的238个内生细菌菌株中筛选出了13个菌株对烟草疫霉菌有平板拮抗作用,占总数的5.5%,这些拮抗菌为来自于烟草根部和茎部的内生细菌,最大抑菌带宽为10mm,最小抑菌带宽为3mm,见表1和图1。3.3不同施菌方式对烟草黑测定结果的影响在4～6叶期烟苗温室控病试验初测中,平板上抑菌效果较好的57、93、118菌株对烟草黑胫病防效较好,见表2。在待测菌施用方式试验中,不同施菌方式的控病效果不同。施菌方式Ⅱ控制烟草黑胫病效果最好,57、93、118菌株的防效均在60%以上。其余两种施菌方式防效较差,在Ⅰ、Ⅱ两种施菌方式中处理比对照晚1～2d发病,而第3种施菌方式中处理与对照同时发病。虽然第3种施菌方式比第1种施菌方式多施两次待测菌,但防效差异不大,而且发病较早,见表3。经鉴定,118、57、93菌株分别为芽孢杆菌属、芽孢杆菌属和假单孢杆菌属。3.4细菌生长方面的抑菌带在PDA平板上,进行了菌株118的抗菌谱鉴定,结果该菌能抑制小麦纹枯病病菌(R.cerealis)、茄褐纹病病菌(P.vexans)、棉花立枯病病菌(R.solani)、烟草灰霉病病菌(B.cicerea)、烟草炭疽病病菌(C.nicotianae)、玉米小斑病病菌(B.maydis)、烟草赤星病病菌(A.alternata)、棉花黄萎病病菌(V.dahliae)、烟草黑胫病病菌(P.parasiticavar.nicotianae)等的生长,均产生了抑菌带。可见,菌株118的抗菌谱较广,对几种烟草主要病害病原菌均有不同程度的拮抗作用,尤其是对烟草黑胫病菌的拮抗作用较明显,见表4。3.5118.肛门直肠广告试验结果表明,菌株118对烟草有明显的促生作用,鲜重增产率为13.10%。4菌株的用量和添加量对菌株生(1)本试验中从烟草根、茎、叶中共获得了238个内生细菌菌株,其中分离自烟草根、茎部的118、93、57等菌株对烟草黑胫病均有较好的抑菌和防病效果。烟草黑胫病主要是发生在根茎部的病害,因此,在烟草根茎部很有可能分离到对烟草黑胫病控制效果更好的内生细菌,这方面还有待进一步研究。(2)施用待测菌的方式不同,其防治效果不同,118菌株以移栽时施1次待测菌,接种病原菌前18d、7d各施1次待测菌的防效较高。可能是因为移栽时施菌,根系有伤口,易于内生细菌进入烟株体内,随着烟苗的生长内生细菌在烟草体内定殖、繁殖、转移,可使烟株体内内生细菌种群数达到一定量,接种病原菌前18d、7d再次施菌能强化内生细菌