连钱草总三酸的分离纯化工艺研究

连钱草总三酸的分离纯化工艺研究

连草是嘴唇科多年生草本植物的活血丹[gleco]kupr。主要产于江苏省和浙江省。它具有润湿可洗、清热解毒、分散渣和囊肿的功效。现代医学表明,连钱草具有治疗胆固醇结石及抗炎作用。据有关文献报道,连钱草中主要含三萜酸类成分,如齐墩果酸、熊果酸等。笔者在本实验中以连钱草总三萜酸含量为指标,研究了AB-8大孔吸附树脂纯化连钱草总三萜酸的最佳工艺条件。1仪器和试剂盒1.1仪器1.2试剂2方法和结果2.1熊乳酸分光光度法2.1.1标准品溶液的制备精密称取熊果酸对照品9.8mg,置于100mL量瓶中,加无水乙醇溶解后,定容至刻度,摇匀,即得0.098mg·mL-1熊果酸储备液。2.1.2显色方法分别精密量取0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20,1.40mL熊果酸储备液,水浴挥干,分别加5%香草醛-冰醋酸液0.4mL、高氯酸0.8mL,置60℃水浴加热10min,冰浴冷却后,加冰醋酸5.0mL摇匀,用紫外分光光度法在546nm波长处测定其吸光度。2.1.3标准曲线的绘制以熊果酸浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,得到标准曲线,其回归方程为:A=6.0117C+0.0933,r=0.9995,线性范围为0.020～0.140mg·mL-1。2.2树脂吸附特性2.2.1树脂的预处理树脂均先经95%乙醇浸泡充分溶胀,倒出乙醇及漂浮物,装填入适当的玻璃柱中,用95%乙醇反复冲洗至洗脱液无混浊出现。用纯化水反复冲洗,至无醇味,备用。2.2.2三萜酸粗提液的制备将连钱草粉碎至粗粉,用50%乙醇回流提取2h,取滤液;同法再操作2次,合并滤液,浓缩成6.260mg·mL-1连钱草总三萜酸粗提液。2.2.3静态吸附与解吸精密称取D101、AB-8、NKA-93种型号树脂各1.00g,置于50mL具塞锥形瓶中,加入6.260mg·mL-1三萜酸粗提液10mL,置于摇床,30℃振摇24h,过滤,得滤液1,测其三萜酸浓度(C1)。取出吸附饱和的树脂,加入50%乙醇10mL,同样温度条件下振摇24h,再过滤,得滤液2,测其三萜酸浓度(C2)。分别以吸附率和解吸率为考察指标,观察各树脂的吸附性能。①吸附率(%)=(C0-C1)/C0×100%;②吸附量=(C0-C1)×V/C0;③解吸率(%)=C2/(C0-C1)×100%。式中C0为粗提液原液浓度(mg·mL-1),C1为吸附后剩余溶液浓度(mg·mL-1),C2为洗脱液浓度(mg·mL-1),V为洗脱液体积(mL)。结果见表1。2.2.4最佳树脂吸附等温线测定精密称取AB-8大孔树脂1.00g,分装于5个50mL具塞锥形瓶中,分别加入不同浓度的连钱草三萜酸溶液10mL,置于摇床,30℃振摇24h,过滤,测定溶液中三萜酸的浓度。根据吸附平衡后吸附量与溶液中三萜酸浓度之间的关系,得到该树脂的吸附等温线,如图1所示。由图1可见,吸附等温线是渐进线,这样的吸附行为符合Langmuir吸附等温线,可认为AB-8树脂吸附了连钱草三萜酸后便达到饱和而不能进一步吸附,故可认为AB-8对连钱草三萜酸为单分子层吸附。2.2.5AB-8树脂的动态吸附实验选用(20mm×300mm)的色谱柱,湿法装柱,以浓度为2.27mg·mL-1,流速为2BV·h-1,分步收集流出液,定时测定流出液中的三萜酸浓度,然后以洗脱液体积为横坐标,流出液中三萜酸含量为纵坐标,绘制动态吸附曲线。吸附达到饱和后,计算饱和动态吸附量(图2)。从图2可见,AB-8树脂吸附浓度为2.27mg·mL-1三萜酸料液时,从第2树脂床体积三萜酸就开始泄漏,但树脂床饱和吸附可达6BV。在生产中可考虑采用树脂柱串联以充分发挥树脂的吸附性能。2.2.6原液pH对树脂吸附性能的影响pH主要通过影响三萜酸在水中的溶解度从而影响其吸附性能。实验中发现,三萜酸化合物在较低pH时,溶液呈絮状混浊状态,随着pH增高,溶液逐渐澄清,并且不同pH的浓缩液在色谱柱中的扩散速度也有明显差别,pH偏高或偏低均使扩散速度变慢(表2)。由表2可看出,使用70%乙醇洗脱过程中,产物的纯度和洗脱率随着pH的变化而变化,在pH=6时,产物的洗脱率达到最大。实验中发现,pH较大和较小时,浓缩液在树脂上部形成絮状沉淀,堵塞严重,严重影响洗脱效率。因此,pH=6较为适宜。2.2.7乙醇浓度对AB-8树脂洗脱效果的影响洗脱剂具有使大孔树脂溶胀,减弱被吸附物质与树脂之间的吸附力的作用,并可溶解被吸附物质。在原液pH=6下,以乙醇作为洗脱剂进行解吸附的洗脱效果见表3。可见,95%乙醇的洗脱率最高,但70%乙醇洗脱获得产物的纯度最高,综合考虑洗脱率和产物浓度,本实验确定70%乙醇适宜洗脱树脂。2.2.8重复性实验按照上述实验结果,连钱草总三萜酸上样浓度为2.27mg·mL-1,流速为2BV·h-1;以70%乙醇在pH=6的条件下洗脱,重复5次,结果三萜酸洗脱率为56.03%,相对标准偏差(relativestandarddeviation,RSD)=1.18%;产物纯度为40.08%,RSD=1.17%。见表4。2.3洗脱曲线及检出限2.3.1渗漏曲线和洗脱曲线考察按上述条件上样并用大量水冲洗,以每10mL为1份,收集此过程的流出液,测定连钱草总三萜酸的含量,以累积渗出浓度(Y)和体积(X)作图,绘制渗漏曲线(图3)。并按每10mL为1份收集洗脱液,测定连钱草总三萜酸含量,并绘制洗脱曲线(图4)。从图4可知,0～10mL洗脱液中几乎不含三萜酸成分;>10mL洗脱液中三萜酸成分含量逐渐增加,并在30mL时达到最大;而80mL以后的洗脱液中三萜酸含量已经很少。因此为了节省时间,提高效率,一般取10～80mL洗脱液即可。3酸含量测定结果连钱草中三萜酸类成分可以通过大孔树脂吸附进行分离纯化。通过对三种树脂吸附性能对比筛选,认为AB-8树脂适合连钱草三萜酸的纯化。最佳工艺条件为:在浸提浓缩液pH=6时,洗脱剂乙醇为70%时采用AB-8大孔树脂进行纯化效果最佳,产品的收率和纯度都较高。大孔树脂是一种不含交换基团、具有大孔结构的有机高聚物吸附剂,具有吸附和分子筛的双重作用。具有成本低、可再生等优点,适合工业纯化有效成分。本次研究的结论可以为工业上纯化连钱草中三萜酸成分提供理论基础,为进一步研究打下基础。SartoriusBP110S电子天平(德国),TU-1901紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),RE-2000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),BPZ-6090LC真空干燥箱(上海跃进医疗器械厂)。熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号