连钱草萃取物的制备及其抑菌活性研究

连钱草萃取物的制备及其抑菌活性研究

随着社会主义现代化的推进，社会经济发展水平不断提高，人们对环境素质的要求也越来越高。植物起源和农药的研究吸引了国内外学者的关注。近20年,我国植物源农药的研制相当活跃,已生产和实际应用了40多种植物源杀虫剂,100多家植物源农药生产企业。植物是生物活性化合物的天然宝库,其产生的次生代谢产物超过40万种。研究表明,万寿菊、丁香、地肤子、苍耳、土木香等对植物病原菌均有一定的抑制作用。本实验室研究表明,鸦胆子对甜菜夜蛾有较强的杀虫活性,并首次在鸦胆子中分离鉴定了2个具有杀虫活性的化合物。因此,对这些有生物活性的植物进行研究,不仅可以为植物源农药的开发提供理论依据,还可以发现新的先导化合物,进行模拟合成,开发新型农药。连钱草(Glechomalongituba(Nakai)Kupr.)别名活血丹、金钱草、遍地香。为唇形花科,活血丹属。除西北、内蒙古外,全国各地均产。有研究表明,连钱草对金黄色葡萄球菌极度敏感,对痢疾杆菌、绿脓杆菌、伤寒杆菌中度敏感。杨念云等从连钱草全草中分离并鉴定了10个黄酮类化合物。本文以苹果腐烂病菌(ValsamaliMiyabeetYamada.)、棉花立枯病菌(ThanatepephoruscucumerisDonk.)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.cucumerinum)和番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)为指示菌,测定了连钱草萃取物的生物活性,为其进一步的开发利用提供理论依据。1材料和方法1.1试验植物材料1.2黄瓜衰落病原菌numoxsporuscucunum苹果腐烂病菌(ValsamaliMiyabeetYama-da.)棉花立枯病菌(ThanatepephoruscucumerisDonk.)黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.cucu-merinum)番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)由中国农业科学院植物保护研究所农药毒理及天然产物化学研究组提供。1.3测试方法1.3.1包括千草乙醇提取、制备1.3.2毒力的回归方程菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落的直径-处理菌落的直径)/对照菌落的直径×100式中菌落直径(cm)=测量菌落直径平均值-0.4利用DPS统计软件对数据进行分析,计算毒力回归方程及EC50。2结果与分析2.1不同萃取物对植物a表1结果表明:连钱草萃取物对4种植物病原真菌均有一定的抑制活性,其中氯仿萃取物对棉花立枯病菌的抑制作用最强,EC50为0.6193mg/mL。其次是番茄灰霉病菌和黄瓜枯萎病菌,EC50分别为1.5563mg/mL和1.6898mg/mL。而极性较小的石油醚萃取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物对4种植物病原真菌的抑制活性均较强,其中石油醚萃取物对4种植物病原真菌的EC50分别为:0.8373、3.5178、1.4960、2.3517mg/mL,氯仿萃取物对4种植物病原真菌的EC50分别为:0.6193、4.4586、1.6898、1.5563mg/mL。表2结果表明:对于棉花立枯病菌和番茄灰霉病菌,氯仿萃取物的抑制活性最强,EC50分别为0.6193mg/mL和1.5563mg/mL,其次是乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物。而对于苹果腐烂病菌和黄瓜枯萎病菌,石油醚萃取物的抑制活性最强,EC50分别为3.5178mg/mL和1.4960mg/mL。综合来看,连钱草萃取物中极性较小的石油醚萃取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物对4种植物病原真菌的抑制活性较强,根据相似相溶原理可知,连钱草中对4种植物病原真菌的生长起抑制作用成分的极性较小,因此有必要对连钱草中极性较小的萃取物进行进一步的分离。表1连钱草萃取物对4种植物病原真菌抑制活性的测定结果表2连钱草萃取物对4种植物病原真菌抑制活性大小比较结果3连钱草萃取物的抑制作用连钱草萃取物对4种植物病原真菌均有一定的抑制活性,且极性较小的石油醚萃取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物对4种植物病原真菌的抑制活性较强,根据相似相溶原理可知,连钱草中对4种植物病原真菌的生长起抑制作用成分的极性较小,因此有必要对连钱草中极性较小的萃取物进行进一步的分离,确定其活性成分,为连钱草的进一步开发利用提供理论依据。而开展连钱草抑菌活性成分的研究,对发现高效、低毒、作用位点单一的农药先导化合物也具有积极意义。从对植物病原真菌的抑制作用来看,连钱草萃取物对棉花立枯病菌的抑制作用最强,其次是黄瓜枯萎病菌和番茄灰霉病菌。在实验结果的调查中发现,连钱草萃取物处理的苹果腐烂病菌的菌落不同于多菌灵处理的苹果腐烂病菌的菌落,推想连钱草萃取物对苹果腐烂病菌的抑制作用机理可能与多菌灵对苹果腐烂病菌的抑制作用机理不同,而两者的抑制作用机理是否真正不同,还需要进行进一步的实验验证。连钱草(Glechomalongituba(Nakai)Kupr.)全株,购于河北省安国市新华中药材有限责任公司。采用超声波提取法:将连钱草经DGF2100型植物粉碎机粉碎,过40目筛,称取3kg干粉,按料液比为1:6的比例,依次加入95%、80%、70%的乙醇,每次均在40℃,80Hz的条件下超声30min,之后静置24h,抽滤得滤液,将3次的滤液合并,用减压旋转蒸发器蒸发浓缩至膏状,收集于棕色瓶中,置4℃冰箱中保存备用。采用液液分配萃取法:将连钱草乙醇提取物加入4倍量的水溶解。依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行连续等量的萃取,减压浓缩萃取液,分别得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物的浸膏,分别称重后置4℃冰箱中保存备用。1.3.3生长抑制率测定参照陈年春的生长速率测定法:将各萃取物用6%的DMSO分别配成5、2.5、1.25、0.625、0.3125g/L5个浓度梯度,以培养皿中加入等量蒸馏水作为空白对照,以加入等量6%的DMSO作为溶剂对照,并设多菌灵(石家庄金田化工有限公司、80%WPCarbendazim)为阳性对照,在培养皿中加入带药培养基,待培养基凝固后,用灭过菌的内径为4mm打孔器在培养好的病原菌上打孔取样,得到直径为4mm的菌饼,放入带药培养基的中央,每皿一个菌饼,