连钱草高效液相指纹图谱研究

连钱草高效液相指纹图谱研究

连草是嘴唇科的一种活血丹[glechomalanovac]的干燥部位，具有湿洗、清热解毒、散瘀、肿胀等功能。近年来,有关连钱草的深入研究受到不少药学工作者的青睐,相继有学者对其所含的三萜酸类、黄酮类等化学成分进行了分离提纯,并建立了三萜酸类(主要为齐墩果酸和熊果酸)及黄酮类(主要为总黄酮、芹菜素和木犀草素)成分的定量分析方法,以此来更好地控制该药材的质量。但中药提取物是多种活性成分的混合体,其药效不是来自单一的活性成分,采用任何单一的活性成分或指标都难以准确地评判中药的真伪和优劣,这种测定单一成分含量的方法并不能全面反映连钱草药材的内在质量。笔者在本实验中采用高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)建立了连钱草的色谱指纹图谱,并对不同产地连钱草的指纹图谱进行了比较分析,研究连钱草药材之间差异。1试剂和仪器SHIMADZU高效液相色谱仪(包括LC-20AT梯度二元泵,SPD-20A检测器,日本岛津),金利超声清洗器(上海杰里科技有限公司),DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂),SHZ-ⅲ型循环水真空泵和RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),101-1AB型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司),METTLERTOLEDO320pH计(瑞士)。芹菜素对照品(南京青泽科技医药科技开发有限公司),甲醇、乙腈(色谱纯,FisherScientific),其余试剂均为分析纯,水为超纯水。连钱草药材见表1。除去杂质,自然晾干,粉碎,过内径0.425mm(40目)筛,使用前60℃干燥4h。2方法2.1连钱草提取方法取芹菜素对照品适量,加甲醇溶解并稀释,配制成1mg·mL-1的对照品溶液。采用四因素三水平正交设计,包括乙醇用量、提取时间、提取次数和乙醇体积含量。以色谱主要峰面积(单峰面积>1%)和各水平极差(R)为评价指标,最终确定的连钱草提取方法为:称取连钱草药材2g,用80%乙醇30mL超声提取30min,共提取4次。将连钱草药材粉碎,过筛孔内径0.425mm(40目)筛,60℃干燥4h。精密称取2g,用80%乙醇超声提取4次,每次30mL,滤过,合并滤液,置旋转蒸发仪减压回收溶剂至干,用80%乙醇转移至25mL量瓶中,定容,用孔径0.45μm微孔滤膜滤过后备用。折合药材浓度为80mg·mL-1。2.2流动相梯度设计由于中药样品成分复杂,色谱条件较难确定,笔者借助计算机辅助优化软件DryLab[液相资源公司(LCResourcesINC.)的计算机模拟软件,用于等度和梯度色谱条件预测]进行优化。以湖北恩施产连钱草提取液为优化对象。流动相选用(A)甲醇(0.5%醋酸,V/V)-(B)水(0.5%醋酸,V/V),初始梯度洗脱程序为:A/B(5/95→95/5,V/V),tG=45min,最晚流出峰和最早流出峰的时间差△tR与梯度时间tG之比远大于0.4,适于梯度洗脱。仪器的系统滞留体积,(VD)约为3mL。遵照DryLab软件设计方法,设计优化梯度速率和温度的条件,流动相梯度范围为A/B(5/95→95/5),温度范围为30～50℃,如图1所示。HypersilODS2(4.6mm×200mm,5μm);流动相:甲醇(0.5%醋酸,V/V):水(0.5%醋酸,V/V),梯度洗脱;流速:1mL·min-1;柱温:40℃;检测波长:0→60min330nm,60→90min280nm;进样体积:20μL。梯度洗脱程序见表2。3结果3.1指纹图谱的建立及相似度评价将以上条件下得到的主要峰的保留时间和峰面积,以及滞留体积输入DryLab中,经过色谱峰校对后,得到梯度速率和温度的两因素分辨图,见图2。如图2所示,梯度时间从50min延长到90min,梯度变化速率从1.8%·min-1到1%·min-1(梯度范围/梯度时间)均可增加分离度;而柱温从30℃到50℃,分离度也得到改善。40℃以后,分辨率增加不明显,为延长色谱柱使用寿命,最后确定柱温为40℃。在梯度洗脱过程中,除梯度速率对色谱行为有影响外,梯度范围对于色谱峰在时间轴上的均匀分布及增加柱的峰容量也有显著影响。由于DryLab以4个基本梯度为基础已经构建出模型,对梯度的修改可以直接在软件中进行。最后确定以15min为分界点,在DryLab中模拟结果如图3所示。以上述条件实际进样分析所得色谱图如图4(A)所示。实验过程中,对梯度分界进行了微调,即以12min为分界点,前段梯度速率为2.8%,后期梯度速率降低至0.75%·min-1,得到图4(B),峰形满足实验要求。采用分段检测波长的方法,即前期(0→60min)采用330nm为检测波长,后期(60→90min)采用280nm为检测波长。连钱草样品在上述色谱条件下,测得色谱图可分为两个区域:30min之前的谱峰密集区和随后的谱峰稀疏区。34min附近均有一个中等强度峰(峰7),经在线紫外光谱和加入对照品溶液的方法证实为芹菜素,选择它为参照峰(标记为S)。在此基础上求出所有色谱峰的相对保留值。在各产地连钱草的指纹图谱中,比较10个不同产地连钱草指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间、峰面积、分离情况等,确定了13个共有峰,这些色谱指纹峰为连钱草样品的100%共有峰,这13个色谱峰为连钱草的基本组成成分,可作为鉴别连钱草样品的必要条件之一。不同产地连钱草指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积(共有峰与参照峰峰面积的比值)分别见表4,5。13个共有峰相对保留时间的RSD<0.483%,但相对峰面积的RSD>57.04%,说明不同产地连钱草所含的共有化学成分的含量差异较大。中药色谱指纹图谱的相似度评价是指纹图谱用于中药质量评价和质量控制的重要环节。笔者在本实验中以10个产地连钱草指纹图谱中各共有峰的平均数建立标准指纹图谱,采用夹角余弦作为相似度的评价指标,以相对峰面积为参数,用SPSS软件计算10个产地连钱草的指纹图谱和标准指纹图谱之间的相似度和样品之间的相似度。结果产自湖北咸宁、湖北十堰、湖北恩施、湖北荆州1、湖北荆州2、湖北武汉、安徽六安、贵州安顺、江苏盱眙和对照药材的相似度分别为0.918,0978,0.961,0.933,0.905,0.945,0.970,0.949,0.910,0.942;上述各产地药材与对照药材之间的相似度分别为0.916,0.973,0.930,0.948,0.845,0.923,0.960,0.985,0.884。各产地连钱草药材的相似度均>0.9,反映了不同产地连钱草药材的同源性。对各产地与对照药材之间的相似度分析,除湖北荆州2和江苏盱眙的相似度分别为0.845和0.884,其他产地均>0.9。进一步应用SPSS软件,采用组间关联法(between-grouplinkage),选用夹角余弦为测度,进行聚类分析。10个产地的连钱草药材可分为3类:湖北恩施、湖北武汉、湖北十堰、湖北荆州1和对照药材为一类;安徽六安、贵州安顺、湖北咸宁和江苏盱眙为一类;湖北荆州2单为一类。从药材来源上讲,湖北荆州1和湖北荆州2均来自于同一地区,只是采集时间不同,且前者为种植,后者为野生,但两者在三大分类中各占一类;从其共有峰的相对峰面积来看,峰2、峰8-13的相对峰面积均存在较大差异。其他各产地共有峰的相对峰面积也存在较大差异。这说明连钱草所含化学成分的含量可能与其生长环境、栽培方式、采收时间等有关。见图5。4连钱草高效液相色谱图的建立及相似度评价中药指纹图谱反映了该中药的化学组成及其含量分布状况,可实现对中药的多组分和多指标分析。对鉴别药材的真伪优劣及其稳定性均具有非常重要的参考价值。对中药进行色谱方法的开发是建立指纹图谱的关键步骤,同时也是耗时最长、耗费最大的一步。借助计算机辅助优化软件DryLab,笔者在本实验中对连钱草样品进行了提取方法、流动相组成以及洗脱梯度程序,检测波长等色谱条件进行了优化,完成了系统的方法学考察,建立了连钱草高效液相色谱指纹图谱,并对连钱草高效液相色谱图谱的相似度进行了评价。采用夹角余弦为测度,聚类分析表明,10种不同产地、来源的连钱草可根据其指纹图谱分成三大类,恩施,武汉,十堰,荆州1,对照品为一类,安徽,咸宁,贵州,咸宁,江苏为一类,荆州2单为一类。10种湖北产地连钱草药材有13个共有指纹峰,所含化学成分在组成上非常相似,但在含量方面仍存在一定差异,表明连钱草药材的质量与其生长环境密切相关,与采收时间