木霉对烟草疫霉生长的拮抗作用

木霉对烟草疫霉生长的拮抗作用

卷烟感染是引起黑烟疾病的唯一病因。它可能会影响种植在各种杂草上的香烟、香烟、烟雾弥漫、皮肤颜色的气味、白烟等。严重的有害因素发生在卷烟植株，通常导致整个植株的死亡。这种疾病通常导致香烟植株的萎缩和死亡，并对牧草生产造成严重破坏。目前生产上用来防治烟草黑胫病的化学药剂多为苯基酰胺类及乙磷铝等内吸性杀菌剂.为了克服因长期采用化学药剂使病原菌产生抗药性,以及环境污染和农药残留等弊端,研制高效且对环境安全的生物杀菌剂成为新一代农药研制的发展方向.目前已发现许多微生物对植物病原真菌具有拮抗作用,木霉菌(Trichodermaspp.)就是一类具有开发应用前景的生防菌.本研究以烟草疫霉菌为靶标真菌,研究木霉菌对烟草疫霉菌的拮抗性和防治效果.1材料和方法1.1绿色木霉tviruse和烟草疫霉菌哈茨木霉(T.harzianum)菌株TGY040604,绿色木霉(T.viride)菌株TG050601、TG050609、TZ050610由福建农林大学植保学院线虫研究室分离、纯化、保存.烟草疫霉菌由云南玉溪烟科所夏振远老师馈赠.1.2对病原菌的培养采用伤根接种法进行致病性测定:用小刀刺入土壤中使植株部分根系受损,将50mL烟草疫霉菌游动孢子悬浮液(105个·mL-1)灌入土壤中,以灌等量灭菌水作为对照.28℃、相对湿度80%-90%下进行室内培养.每一处理3株烟苗,3次重复.10-15d后检查结果,并对病株进行再分离,以明确供试病原菌的致病性.1.3生育木菌的筛选1.3.1接种木霉和疫霉菌的相互作用参考程丽云的方法,采用直径6mm的打孔器打取木霉菌和烟草疫霉菌的菌饼,在距离PSA平板中心2.5cm的相对2点上分别接种木霉和疫霉菌,以不接木霉菌、只接疫霉菌为对照,置于28℃恒温培养箱中培养.每一处理3次重复.接种后第2天开始逐日测量两接种点连线上疫霉菌的菌落半径,计算抑菌率.当两菌落接触后,观察记载木霉菌对病原菌的抑制、包围、侵入并占领疫霉菌生长空间的过程,挑取交接部位菌丝在显微镜下观察木霉菌与疫霉菌的相互作用.1.3.2接种木霉饼后接种疫霉菌饼参考文献的方法,在培养皿的底和盖上倒入等量(15mL)PSA培养基,制成平板.抑菌试验组在培养皿盖上接种活化培养4d的木霉菌饼(直径6mm),在其底上接种疫霉菌饼;对照组只在皿底接疫霉菌而盖上不接木霉;将培养皿倒置于28℃恒温培养箱中培养,每处理重复3次.在接种后24、48、72h分别测量疫霉菌的菌落直径,计算抑菌率.1.3.3psa培养基的制备参考朱天辉等的方法,将木霉菌接于PSA斜面上培养6-7d,待大量产孢后用灭菌水洗下孢子,采用血球计数法计数,配成107个·mL-1的孢子悬浮液;取1mL孢子悬浮液加入装有100mLPS培养液的250mL三角瓶中,在28℃、180r·min-1的摇床中培养5d,过滤去除菌丝体;用旋转蒸发仪将滤液蒸馏浓缩为原体积的1/4,浓缩液用灭菌的滤膜(直径0.22μm)过滤除菌,将无菌滤液与PSA培养基按1∶9的比例混匀后倒平板,每皿15mL;在平板中央接种培养4d的疫霉菌饼(直径6mm),置于28℃恒温培养箱中培养.对照:将无菌水与PSA培养基按1∶9的比例混匀后倒在平板上培养疫霉.在接种后24、48、72h分别测量疫霉菌的菌落直径,计算抑菌率.抑菌率计算方法同1.3.2.1.4防治效果评价选择生长一致、苗龄60d左右的烟苗,移栽于装有灭菌土的花盆中(18cm×24cm),缓苗10d.烟草疫霉菌游动孢子悬浮液的制备参考郑小波的方法,孢子含量为105个·mL-1.木霉菌孢子悬浮液的配制方法同1.3.3,孢子含量为107个·mL-1,盆栽防治试验设以下3个处理.A:50mL木霉菌(TG050609)孢子悬浮液与50mL疫霉菌游动孢子悬浮液的混合液.B:50mL1mg·mL-1的甲霜灵锰锌药液与50mL疫霉菌游动孢子悬浮液的混合液.C(对照):50mL清水与50mL疫霉菌游动孢子悬浮液的混合液.用上述混合液灌根接种,方法同1.2.接种后于20℃下黑暗处理24h,然后在28℃、相对湿度为80%-90%的条件下进行室内培养,10d后观察各处理烟苗的发病情况,计算发病率、病情指数及防治效果.每一处理15株烟苗,每个处理3次重复.2结果与分析2.1茎内染色病株13烟苗接种后第10天开始发病,首先根茎部位出现黑斑,并迅速向纵向和横向环茎扩展,第13天黑斑环绕整个茎基部;病原菌侵染茎基部后很快向髓部扩展,纵剖病茎可见髓部呈黑褐色;病株叶片自下而上依次变黄,中下部叶片形成圆形褐色大病斑,萎蔫下垂;最终病株枯死,拔出病株可见根系变褐坏死;取病株进行分离,可分离到烟草疫霉菌(图1).2.2木霉对草真菌病的抗性2.2.1烟草疫霉丝相关病原菌生长特性木霉与烟草疫霉对峙培养试验结果表明,木霉菌对烟草疫霉有一定的抑制作用(表1),其中绿色木霉菌株TG050609对烟草疫霉生长的抑制作用显著.该菌株生长快,能迅速占领营养空间,并能覆盖烟草疫霉的菌落.对峙培养48h后,在木霉菌丝与烟草疫霉菌丝交接处挑取菌丝在显微镜下观察,可以观察到木霉菌丝缠绕于烟草疫霉菌丝上,产生吸器或类似吸器的结构穿入疫霉菌丝,疫霉菌丝出现原生质浓缩、菌丝断裂和消解等现象.对峙培养中,菌落生长状况表明病原菌生长受抑制,木霉菌能持续生长,并侵入疫霉菌落中,在疫霉菌落上生长蔓延;疫霉菌落最终萎缩消解,形成大量绿色孢子(图2).2.2.2木霉菌对烟草疫霉的影响结果表明,木霉菌生长过程中产生的挥发性代谢物能抑制烟草疫霉的生长(表1).接种后72h的观察结果表明,供试的4个木霉菌株中,绿色木霉TG050609产生的挥发性代谢物对烟草疫霉生长抑制效果最大,抑制率达37.34%.挑取烟草疫霉菌丝进行显微观察,结果表明在木霉菌产生的挥发性代谢物质作用下烟草疫霉出现菌丝生长畸形、原生质浓缩、菌丝缢缩断裂和消解等现象(图3).2.2.3木霉对烟草疫霉的生长抑制率结果表明,木霉菌发酵滤液能抑制烟草疫霉的生长.接种后72h的观察结果表明,绿色木霉菌株TZ050610和TG050609发酵滤液对烟草疫霉菌的生长抑制率分别达到45.06%和43.03%(表1).从木霉发酵滤液培养基上挑取烟草疫霉菌丝进行镜检,可见菌丝扭曲畸形、中央缢缩断裂、菌丝消解等现象(图4).上述试验结果表明,木霉对烟草疫霉生长具有抑制作用,不同木霉菌的抑制效果有差异.供试的4株木霉菌中以绿色木霉菌株TG050609对烟草疫霉的抑制效果最显著.该菌株进一步用于烟草黑胫病盆栽防治试验.2.3烟苗和烟苗抗菌防治盆栽接种试验结果表明,用58%甲霜灵锰锌WP防治烟草黑胫病,烟苗发病率为62.23%,病情指数为24.43,相对防效为42.10%.用木霉菌TG050609孢子悬浮液防治烟草黑胫病,烟苗发病率为53.30%,病情指数为18.33,相对防效为56.53%,略优于58%甲霜灵锰锌WP(表2).3烟草疫霉菌生防作用木霉菌对植物病原菌的防治主要是通过竞争作用、重寄生作用和抗生、溶菌作用,其在生长过程中产生的代谢物质使病原菌菌丝细胞质消解,菌丝断裂、溶解,从而抑制病原菌的生长.结果表明,木霉菌TG050609对烟草疫霉菌具