镉对不同镉积累模式烟草根系分泌有机酸的影响

镉对不同镉积累模式烟草根系分泌有机酸的影响

镉（cd）是已知的生物毒性因子之一，能在土壤中稳定积聚，难以去除，并且容易被植物吸收和积累。进入人体后，通过食物链进入人体，并积聚在一定程度上人体。烟草是我国重要的经济作物,随着社会对烟草的关注度越来越高,烟草的安全性问题日益凸显。烟叶中的镉主要来源于土壤,最近研究发现,与20世纪90年代相比,中国植烟土壤重金属元素呈现出不同程度富集趋势,镉的富集较为明显,可能导致烟草中镉积累的风险增加。作物对镉的吸收存在基因型差异,利用这种差异已经培育出了低镉积累的小麦、向日葵、大豆等品种,对降低作物镉含量起到了积极作用。有研究发现,不同类型的烟草对镉的吸收也存在基因型差异,普通烟草表现为根系和叶片积累,黄花烟草则以根系积累为主,黄花烟草的耐镉性强于普通烟草,然而目前尚不清楚造成镉积累基因型差异的相关机制。植物根系分泌物尤其是低分子量有机酸可与土壤中的镉螯合,形成“镉-低分子有机酸”复合物,促进土壤中镉的释放和植物对镉的吸收,因此,根系分泌物高效溶解土壤镉的能力可能与烟草镉的富集有关。有研究表明,根系分泌有机酸组成差异是造成作物矿物积累差异的原因之一,但其在烟草耐镉机制中的作用尚不清楚。为此,以根系镉积累效率不同的两个烟草基因型为材料,考察烟草根系分泌低分子量有机酸与烟草镉吸收的关系,为揭示烟草吸收积累镉的基因型差异提供依据。供试烟草品种为普通烟草品种K326和黄花烟草(N.rustica)。烟草种子经过灭菌后于28℃黑暗条件下催芽,发芽后移入蛭石培养基中培养至6叶1心期备用。烟苗培养在恒温光照培养箱中进行,控制条件为光照16h/d,温度28℃(昼)/18℃(夜),相对湿度为70%。供试土壤为耕层红壤,取自云南烟叶产区。土壤pH为5.31,有机质、碳酸钙、粘粒和全镉含量分别为3.64g/kg,2.44mg/kg,27.61mg/kg和0.31mg/kg。1.2测试方法1.2.1土壤湿度及根际和非根际土壤的处理土壤盆栽试验于2013年5月在郑州烟草研究院温室进行。Cd处理设置CK,1(处理1),5(处理2)和10(处理3)mg/kg4个水平,采用完全随机组合,每处理重复4次。具体操作方法为:采集的耕层土壤样品风干磨碎过2mm筛后,Cd以Cd(NO3)2溶液形式按照上述浓度梯度拌入土壤中,保持土壤田间最大持水量,污染老化处理1个月。处理结束后,拌入NH4NO3,KNO3和KH2PO4作为基肥,N肥用量为0.1g/kg,N∶P∶K=1∶1.5∶3,装入直径18cm高12cm的塑料盆中,每盆装土2kg,将大小一致的6叶1心期烟苗移入盆中,每盆定植1株,室温条件下培养50d。参照Chen等的方法收集根际和非根际土壤。具体操作为:调节盆中土壤湿度使根系能够顺利移出,轻轻抖落根系上的大块土,剩余附着在根系上的土用150mL蒸馏水冲下作为根际土壤的水溶液。取距离根系15cm以外的土壤5g作为非根际土壤,用150mL蒸馏水溶解作为非根际土壤的水溶液。植物样品采集:根系除去表面土壤后用自来水冲洗干净,吸水纸吸干表面水分后和地上部植株样品一起在100℃下杀青10min,然后在65℃条件下烘干至恒质量。1.2.2烟苗的培养和管理设置0.00(CK),0.25(处理1),1.00(处理2),10.00(处理3)和50.00(处理4)μmol/L5个Cd浓度处理,每处理重复3次,每重复两株烟苗。具体操作为:选取大小一致的6叶1心期烟苗,用1/2Hoagland营养液预培养1周后待用。烟苗培养所用容器为体积1.5L的塑料盆,每盆定植6株。培养条件与前期相同,培养期间每3d更换1次营养液。用Cd(NO3)2配置上述浓度梯度溶液,除Cd处理外,培养条件与前期相同,培养48h后烟苗用于收集根系分泌物。Cd处理后将烟苗从盆中取出,先用自来水冲洗3~5次,然后用蒸馏水冲洗3~5次,再用0.5mmol/LCaCl2溶液洗根30min,滤纸吸干表面水分后,将处理好的烟苗根放入含0.5mmol/LCaCl2的遮光容器中(200mL),收集根系分泌物,收集时间为4h,收集液用于根系分泌物低分子量有机酸的测定。1.3低分子量有机酸的测定土壤盆栽试验参照Szmigielask等的方法收集根系分泌物。具体操作:根际和非根际土壤样品的土水混合物振荡8h后,8000g离心15min,离心后的上清液作为根系分泌物的收集液。离心后的上清液和水培收集的根系分泌物样品转入真空旋转蒸发器,40℃下浓缩至近干,用10mL无菌重蒸馏水超声波下溶解,置于-20℃冰箱保存,用于有机酸的测定。参照范洪黎等的方法测定根系分泌物低分子量有机酸并稍作修改,收集液经0.45μm的滤膜过滤后,采用Agilent1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)测定。色谱条件:AgilentHC-C18(2),Analytical4.6×250mm5-Micon型反向色谱柱,流动相为93%25mmol/LKH2PO4(pH2.4)和7%甲醇混合液,等梯度洗脱,洗脱时间为30min。流速为0.7mL/min,进样量为20μL,柱温为(25±2)℃,检测波长210nm。测定11种有机酸,分别为草酸、酒石酸、甲酸、苹果酸、丙二酸、乳酸、乙酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸。采用外标法进行测定,峰面积法计算含量。1.4数据分析采用Excel软件进行数据统计和做图,SAS8.0软件Duncan法进行处理间差异显著性分析。2结果与分析2.1cd对烟株生物量的影响由图1可以看出,随着Cd处理浓度的提高,Cd对烟株生物量的影响表现为低浓度促进生长,高浓度抑制生长。红壤中加入1mg/kgCd时烟株生物量高于对照,之后随镉处理浓度的提高烟株生物量逐渐下降。两基因型烟草对镉处理的响应差异明显。不同镉浓度处理间K326生物量存在显著差异,与对照相比,加入1mg/kgCd处理后烟株生物量显著升高了20.92%,加入5mg/kg和10mg/kg的Cd处理后,生物量分别显著下降了23.97%和51.14%。黄花烟草各处理间差异不显著,表明黄花烟草有较强的耐镉性,这与前人研究结果一致。2.2cd对黄花烟草根系低分子量两氮分泌量的影响土壤盆栽试验结果(图2)显示,3种镉浓度处理下,两基因型烟草根系分泌低分子量有机酸总量的变化趋势与生物量的变化相似,表现为低浓度Cd处理促进低分子量有机酸的分泌,高浓度抑制其分泌。K326在1mg/kgCd处理时低分子量有机酸总量显著高于对照,升高了31.32%;5mg/kgCd处理时开始降低,但与对照相比无显著差异。N.rustica在1和5mg/kgCd处理时低分子量有机酸的分泌量均高于对照,5mg/kgCd处理显著升高了35.96%,且其低分子量有机酸总量显著高于K326。10mg/kgCd处理时开始降低,与对照相比显著下降了41.71%。水培试验结果(图3)显示,黄花烟草根系低分子量有机酸的分泌仍表现出低浓度促进而高浓度抑制的趋势。与对照相比,0.25μmol/LCd处理后,低分子量有机酸总量显著升高了23.22%,之后随着Cd浓度的提高有机酸总量逐渐下降;K326则呈现出随镉浓度升高逐渐下降的趋势,0.25,1.00,10.00和50.00μmol/LCd浓度处理后,根系分泌物总量均显著低于对照,分别为对照的86.02%,80.68%,78.19%和68.95%。所有处理中,N.rustica的有机酸总量均显著高于K326,这与土壤盆栽试验结果一致。有研究表明,植物产生有机酸可以缓解重金属毒性,低分子量有机酸总量越高,对镉的抗性越强。本研究中,无论是土培还是水培条件下的Cd处理,黄花烟草根系分泌低分子量有机酸总量都明显高于普通烟草品种K326。这说明根系分泌较多的低分子量有机酸可能是黄花烟草具有较高耐镉性的原因之一。2.3不同处理对烟草根系产物的活性影响由表1可以看出,土壤盆栽试验中,主要检出的低分子量有机酸为草酸、甲酸、乳酸、酒石酸和马来酸。其中,草酸含量最高,占低分子量有机酸总量的72.34%~93.66%,是烟草根系分泌的主要有机酸。其次是甲酸、乳酸、酒石酸,分别占总量的1.40%~15.46%,1.04%~6.84%和1.02%~4.47%。此外,还检出较低含量的马来酸。不同基因型间也有所差异。K326各处理中还检出苹果酸和含量较低的柠檬酸和富马酸,部分处理中检出了乙酸和丙二酸;N.rustica部分处理中检出了乙酸和丙二酸。除10mg/kg镉处理外,其他处理中N.rustica根系分泌的草酸含量均高于K326;所有处理中N.rustica根系分泌的酒石酸、甲酸和乳酸含量均高于K326。由图4可以看出,两烟草基因型间草酸、酒石酸、甲酸和乳酸占低分子量有机酸总量的比例差异不显著。与土培试验相比,水培条件下较容易保证各重复间pH值、营养及Cd处理浓度的一致性,更有利于提取和鉴定根系分泌物。水培试验中(表1)检出的主要低分子量有机酸含量从高到低依次为草酸、甲酸、乳酸、酒石酸。草酸占烟草根系分泌低分子量有机酸的78.38%~89.43%,是根系分泌的主要低分子量有机酸。甲酸、乳酸和酒石酸分别占总量的8.18%~17.69%,1.11%~2.64%和1.11%~1.59%,在各处理中还检出了含量较低的马来酸和富马酸,部分处理中检出了苹果酸。与土壤盆栽试验相比,水培试验没有检出乙酸、丙二酸和柠檬酸,说明根系分泌物原位收集法和溶液培养收集法所获得的有机酸种类和数量并不完全相同,这与田中民等的研究结果相似。除个别处理外,N.rustica根系分泌的草酸、酒石酸、甲酸和乳酸含量均高于K326。由图5可以看出,两烟草基因型间草酸、酒石酸、甲酸和乳酸占低分子量有机酸总量的比例差异不显著,这与土壤盆栽试验结果相似。综上所述,两基因型烟草对镉的响应机制差异可能与低分子量有机酸的组成比例无特异性关系,而与各低分子量有机酸的分泌量有关。3不同处理对黄花烟草根系物合成的影响(1)低浓度镉处理可促进烟苗生长,高浓度镉处理则抑制烟苗生长,土壤盆栽条件下10mg/kg镉处理对烟草有明显的毒害作用。与K326相比,N.rustica表现出更强的耐镉性。(2)在土壤