阿司匹林丁香酚酯抗炎作用及其机制研究

阿司匹林丁香酚酯抗炎作用及其机制研究

近年来，从解热镇痛到抗炎、抗风湿、抗血小板聚集和抗癌的临床应用越来越广泛和重要，但长期使用对胃肠损伤的损害也越来越明显。因此,为了消除其不良反应,避免阿司匹林中羧基对胃肠道的刺激,减轻该药对胃肠道的直接损伤,笔者将阿司匹林的游离羧基与丁香酚(eugenol)结合,屏蔽了游离羧基,形成一种新的酯类化合物——阿司匹林丁香酚酯(aspirineugenolester,AEE),理论上该化合物具有明显的优势,可降低阿司匹林的酸性对胃肠的不良反应,以及丁香酚的刺激性和易氧化性,同时未改变发挥临床作用的结构部位。急性毒性实验结果表明,实验大鼠解剖未见胃肠道出血和溃疡等不良反应,AEE的LD50为10.39g·kg-1,阿司匹林的LD50为1.5g·kg-1,丁香酚的LD50为2.68g·kg-1,AEE较两种前体药具有明显的低毒优势,提示AEE已达到降低毒性的目的。为了研究AEE是否具有2种前体药的药效,本研究观察了AEE的抗炎作用,并初步探讨其可能的作用机制,以期为AEE的临床应用提供实验依据。1小鼠足跖水肿实验1.1动物、药品、试剂和仪器昆明种小鼠,雌雄兼用,体质量18~22g,由兰州大学提供。饲养环境:温度18~25℃,湿度50%~60%。AEE:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所新兽药工程重点实验室制备,HPLC法测定其纯度>99%;丁香酚:江西汇通药用香料油有限公司,纯度>99%;阿司匹林:武汉合中化工制造有限公司,纯度>99.9%。二甲苯等化学试剂:国产,分析纯。721紫外分光光度计:上海分析仪器厂;LS55型荧光分光光度计:PerkinElmer公司。1.2阿司匹林丁香酚酯、阿司匹林和丁香酚混悬液的制备实验前用浓度0.5%的羧甲纤维素钠溶液配制AEE5和10g·L-1混悬液及阿司匹林10g·L-1的混悬液;将丁香酚与吐温80以2∶1比例混合,加入一定量生理盐水,配制成8g·L-1的混悬液,在漩涡振荡器上充分混匀后密封保存。1.3二甲苯致小鼠耳肿胀测定小鼠50只,随机平均分为5组:模型组(灌服0.5%的羧甲纤维素钠)、阿司匹林0.2g·kg-1组、丁香酚0.18g·kg-1组、AEE0.18和0.36g·kg-1组,小鼠ig给予相应药物,每天1次,连续3d。于末次给药1h后麻醉,二甲苯50μl涂于小鼠右耳郭两面,60min后处死小鼠,用打孔器打下双耳同一部位耳片称重,计算耳郭的肿胀度和肿胀抑制率。肿胀度=右耳片重量-左耳片重量;肿胀抑制率(%)=(模型组肿胀度-给药组肿胀度)/模型组肿胀度×100%。1.4小鼠腹腔毛细血管通透性测定小鼠50只,给药处理同1.3。末次给药1h后尾静脉注射0.5%依文思蓝生理盐水溶液10ml·kg-1,同时ip给予0.6%醋酸10ml·kg-1。1h后处死,用6ml生理盐水反复冲洗腹腔,收集冲洗液并稀释至10ml。1000×g离心15min,取上清液于紫外分光光度计590nm处测定A590nm,以A590nm反映毛细血管的通透性。1.5角叉菜胶致小鼠足跖肿胀实验小鼠180只,随机平均分为6组:正常组及模型组(灌服0.5%的羧甲纤维素钠20ml·kg-1)、阿司匹林0.2g·kg-1组、丁香酚0.18g·kg-1组、AEE0.18和0.36g·kg-1组,给药处理同1.3。末次给药后1h,除正常对照组外其他所有小鼠右后足跖皮内注射1%角叉菜胶0.03ml,4h后脱颈椎处死小鼠,沿踝关节上的标记线剪下左右后足,以左右后足重量差为足肿胀度,计算肿胀抑制率:肿胀抑制率(%)=(模型组肿胀度-给药组肿胀度)/模型组肿胀度×100%。1.6小鼠棉球肉芽肿的检测小鼠50只,分组同1.3。在无菌条件下,于小鼠腋窝部皮下手术植入一个(10±1)(x±s)mg的灭菌青霉素棉球,术后每天ig给药1次,连续7d。7d后处死小鼠,剥离棉球,60℃烘箱内烘干称重,计算小鼠平均每10g体质量增生的肉芽肿质量(mg)。1.7角叉菜胶致小鼠足跖肿胀小鼠致炎足组织中前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)含量的测定取1.5处理小鼠,每组10只,剪下致炎后足,称重,剪碎后分别浸入盛有2.5ml生理盐水的试管中,振摇2h后取出,将浸泡液1000×g离心15min,取上清液0.3ml于另一试管内,加入0.5mol·L-1KOH甲醇溶液1.0ml,50℃水浴20min异构化,加甲醇2.5ml,测定A278nm值,用A278nm值表示PGE2含量。1.8角叉菜胶致小鼠足跖肿胀小鼠致炎足组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的测定取1.5处理小鼠,每组10只,剪下致炎后足,称重,剪碎后分别置于0.45ml20%的三氯醋酸中浸泡4h后弃炎足,在浸泡液中加入0.55mlTBA液(含1%硫代巴比妥酸的盐酸0.1mol·L-1)混匀,90~95℃水浴15min后加2ml生理盐水稀释,1000×g离心5min,取上清液于532nm处测定A532nm,用标准品曲线计算MDA含量。1.9角叉菜胶致小鼠足跖肿胀小鼠血清中一氧化氮(nitricoxide,NO)含量的测定将对氨基苯磺酰胺溶于5%的磷酸中,配制成浓度为1%的对氨基苯磺酰胺溶液100ml,另配置0.1%的盐酸萘乙二胺水溶液100ml,将上述2种溶液等体积混合后即为Griess试剂,4℃保存。取1.4处理小鼠,每组10只,眼眶采血,离心,分离血清100μl,加入等体积Griess试剂,室温反应10min,于波长550nm处测定吸光度(A550nm)值,以A550nm表示NO含量。1.10角叉菜胶致小鼠足跖肿胀小鼠致炎足组织中5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量的测定取1.5处理小鼠,每组10只,剪下致炎后足,称重,剪碎后分别浸泡于4.0ml酸化正丁醇中4h,超声处理20min,弃足离心,取上清液2.5ml,加入正庚烷3ml和0.1mol·L-1的盐酸1.2ml振荡5min,离心弃去有机相,取水相0.5ml,加入0.1ml0.5%半胱氨酸、0.04%邻苯二甲醛3ml和0.02%NaIO40.1ml后沸水浴10min,用荧光分光光度计在激发波长365nm,荧光波长480nm处,测定荧光强度(intenseoffluorescence,IF),表示5-HT的含量。2结果2.1对二甲苯所致的耳郭水肿的影响由表1结果可见,与模型组比较,AEE0.18和0.36g·kg-1均能显著抑制二甲苯所致的耳郭肿胀(P<0.05,P<0.01),其抑制作用与阿司匹林相当,但强于丁香酚。2.2aee对小鼠脏器结构的影响表2结果显示,与模型组比较,各给药组伊文思蓝的渗出均明显减少,表明AEE0.18和0.36g·kg-1能显著降低腹腔毛细血管通透性(P<0.05,P<0.01),与阿司匹林效果相当,丁香酚作用不显著。2.3阿司匹林丁香酚酯对大鼠棉球肿胀的影响表3结果表明,与模型组比较,AEE0.18和0.36g·kg-1均能抑制棉球肉芽组织增生,与阿司匹林和丁香酚作用相似。2.4小鼠急性足跖水肿与模型组比较,AEE0.18g·kg-1组与阿司匹林均能显著抑制角叉菜胶所致的小鼠急性足跖肿胀(P<0.05,P<0.01);丁香酚抑制作用不明显(表4)。2.5aee对炎症组织及血清中相关指标的影响表5结果表明,与模型组比较,AEE0.18和0.36g·kg-1可明显减少炎症组织中PGE2含量(P<0.05,P<0.01),作用与阿司匹林和丁香酚相当。AEE0.18g·kg-1可减少炎症组织中5-HT含量,与阿司匹林和丁香酚作用相似。AEE0.18和0.36g·kg-1对炎症组织中MDA含量无明显影响,阿司匹林和丁香酚可明显降低炎症组织中MDA含量(P<0.05,P<0.01)。AEE0.36g·kg-1可减少角叉菜胶致足跖肿胀小鼠血清中NO含量(P<0.05),与阿司匹林作用相似;AEE0.18g·kg-1和丁香酚对血清中NO含量无明显影响。3从足跖水肿模型及抗炎药物的抗炎作用炎症是具有血管系统的活体组织对局部损伤的反应,可概括分为早、中、晚三期,早期主要表现为毛细血管扩张、通透性亢进、渗出和水肿;中期主要是白细胞向炎灶聚集;晚期则以炎灶屏障形成和组织增生为特点。本实验采用各种急性和慢性炎症模型观察AEE的抗炎作用,二甲苯涂于小鼠耳部,使局部组织损伤,引起局部毛细血管通透性增加,某些炎症介质如组胺、蛋白溶解酶释放,导致渗出性炎性水肿;染料依文思蓝与血浆蛋白结合,当致炎因子诱导毛细血管通透性增高时,在一定范围内染料的渗出量可反映毛细血管渗出的血浆蛋白量;注射角叉菜胶诱发小鼠足跖肿胀模型是模拟炎症肿胀的病理变化,这种方法也是目前常用的炎症水肿模型,其特点是致炎局部白细胞浸润,PGE2合成增加以及补体系统的激活,初期的水肿(致炎后lh内)主要由组胺和5-HT释放所致,致炎后3h时水肿主要由PGE2介导,两期之间的水肿主要是由激肽类物质维持;作为筛选抑制炎症增殖期药物的模型,棉球肉芽肿实验属于增生性炎症实验,棉球埋入小鼠局部皮下后可产生与临床某些炎症后期病理变化相似的肉芽增生,棉球诱导的小鼠肉芽肿模型造成的病理变化符合慢性炎症模型。本研究结果显示,AEE可以明显抑制急性期毛细血管扩张及渗出、炎症中期炎性水肿、慢性肉芽肿,表明AEE具有明显的抗炎作用,与前体药阿司匹林和丁香酚的抗炎作用相当。本研究结果表明,AEE与阿司匹林和丁香酚相似,可抑制环氧酶途径的某个环节,减少炎性介质PGE2含量,同时亦可减少5-HT的含量;但AEE对炎症组织中MDA含量无影响,