酶联免疫斑点技术介绍

酶联免疫斑点技术介绍一、

ELISPOT技术概述1.

技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linkedImmunospotAssay）。它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌状况。其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其体现出来（SedgwickJD）。该技术检测细胞因子含有三大优点：其一，敏捷度高。在一百万个阴性细胞中只要有一种分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。这是现在为止，最为敏捷的检测技术，敏捷度比传统的的ELISA办法高2-3个数量级。其二，单细胞水平，活细胞功效检测。ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功效，而非死细胞的遗留物。其三，操作简便经济，能够进行高筒量筛选。ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。按照原则化的实验操作，一种实验者能够同时解决数百个样品，效率远远高于其它检测办法（KalyuzhnyAE）。实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的规定要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中能够不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌多个细胞因子。细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子能够与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就能够在膜的局部形成一种个圆形的斑点。每一种斑点就对应了当时一种分泌细胞因子的细胞，这些细胞被称为斑点形成细胞（SpotsformingcellsSFCs）。统计膜上的斑点的数目，再除以当时加入孔内的细胞总数，就能够计算出阳性细胞的频率。其实验原理以下所示：1.特异性的单克隆抗体包被在培养板的孔底部；2.封闭所能结合单瓣的其它部位；3.加入细胞及以及刺激物培养，阳性细胞分泌细胞因子，被细胞下方的单克隆抗体捕获；4.移出细胞，洗涤；5.加入生物素标记的第二抗体（和双抗体夹心法ELISA类似）；6.加入酶标链霉亲和素；7加入显色底物，在酶的催化分解下，产生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；8.斑点计数（能够人工计数，也能够使用自动的读板仪来计数），数据解决，成果分析。2.

ELISPOT的发展历史ELISPOT办法从创立至今已有20数年的历史了。1983年，在地球南北两个半球地理位置相距遥远的两个研究小组几乎同时、独立的创立了这项技术。一种研究小组位于澳大利亚西部的柏斯Peth，牵头人是当时正在本地Margaret女王医院小朋友医学研究所攻读博士学位的JonathonD.Sedgwich（SedgwickJDet.al.,1983）。另一种研究小组位于北欧瑞典都市哥德堡Gothenburg，带头人是哥德堡大学医学微生物系的学者CecilC.Czerkinsky（CzerkinskyCCet.al.,1983a）。前者开创ELISPOT办法是为了研究B淋巴细胞分泌IgM抗体的状况（HoltPGet.al.,1984；SedgwickJDet.al.,1984）；而后者除了用于研究B淋巴细胞分泌抗体的状况（CzerkinskyCCet.al.,1983b;1983c），还应用于大肠杆菌分泌肠毒素（CzerkinskyCCet.al.,1983a）和成纤维细胞分泌纤维连接蛋白（CzerkinskyCCet.al.,1984）的研究中。即使研究的对象不同，但是该实验技术所涉及的原理以及办法环节和我们现在的原则ELISPOT几乎完全相似。这二十数年来，ELISPOT基本技术并没有什么重大变化，但是技术进步始终没有停止，实验材料的改善了，实验敏捷度与重复性提高了，实验应用领域也拓宽了。1)

底板材质的改善ELISPOT技术从创立之初，检测底板都是使用的普通塑料板，它的蛋白吸附能力差，因此实验的敏捷度有限。1985年，MollerSA和BorrebaeckCA将膜板引入ELISPOT中（MollerSAet.al.,1985），检测的也是分泌抗体的阳性B细胞。他们引入的是硝酸纤维素膜，获得了远远优于塑料板的成果。1995年，荷兰Utrecht大学免疫研究所的SchielenP团体（该团体后来挂靠Utrecht大学，开办了荷兰U-Cytech公司，成为世界上顶级的ELISPOT试剂盒生产商之一）把一种更优于硝酸纤维素膜的PVDF膜也被引入了ELISPOT检测中（SchielenPet.al.,1995）。做过Westernblot的人都懂得，PVDF膜比硝酸纤维素膜有更优的蛋白吸附性质，更加精细的显色条带分辨率。因此，PVDF的引入是继硝酸纤维素膜之后，ELISPOT底板材料的又一次重大突破（McCutcheonMet.al.,1997）。至今，PVDF膜几乎完全取代了NC膜（WeissAJ）。“反者道之动”。塑料板在被膜板取代之后，沉寂了许数年，现在又开始兴旺起来了（RonnelidJet.al.,1997;OkamotoYet.al.,1997）。最出名的塑料ELISPOT板当数荷兰U-Cytech公司研发的透明板，已经成为了该公司的一大特色。塑料ELISPOT板的重新兴旺有两个方面的因素：首先是技术进步，在塑料材质的改善之后，板底吸附蛋白的能力已经比传统的塑料板有了很大提高，即使还赶不上膜板，但是应付ELISPOT实验已经绰绰有余。更高质量的抗体也有助于塑料板获得更加好的ELISPOT成果。另首先归因于塑料板本身的优势，相对低廉的价格，简化的操作环节，简短的实验时间都是塑料板的优势（RonnelidJet.al.,1997）。另外对于透明板，还能够在实验中随时观察细胞的状态与密度，这对新手是很重要的。2)

检测内容的多样化在ELISPOT技术创立之初，重要用于检测B淋巴细胞分泌的抗体，涉及多个类型的免疫球蛋白，包被的材料是特异性的抗原或者抗体的抗体（HoltPGet.al.,1984；SedgwickJDet.al.,1984）。B细胞分泌的抗体普通的量比较大，容易检测，即使早期ELISPOT检测的敏捷度不够高，检测大量分泌的抗体还是不成问题的（BjorkanderJet.al.,1991;AhlforsEet.al.,1991;HolmgrenJet.al.,1992a）。时至今天，ELISPOT检测还广泛地用来研究粘膜免疫中的抗体分泌状况（HolmgrenJet.al.,）。后来随着技术的进步，ELISPOT检测的敏捷度有了大幅度的提高，以至于能够检测到痕量的细胞因子，于是它的重要应用就转移到检测细胞因子上来了（CzerkinskyCet.al,.1988a;1991;HutchingsPRet.al.,1989）。现在多个常见细胞因子的检测都有了商业化的试剂盒，使用起来非常方面。能商业化检测的细胞因子涉及人类、小鼠、大鼠、猴子、猩猩的干扰素（γ-IFN）、白介素（IL-2，4，5，6，10，12等）、颗粒酶（GranzymeB）、肿瘤坏死因子（TNF-α）。现在全球ELISPOT试剂盒的重要供应商有：荷兰U-CyTech公司、瑞典Mebtech公司、法国Diaclone公司、美国BDPharmingen公司和R&D公司。他们的产品各有特点，其中荷兰U-CyTech公司的产品质优价廉，在国内市场居于主导地位。3)

多细胞因子的检测普通的ELISPOT检测每个孔只检测一种细胞因子。如果要在一种ELISPOT孔内同时检测两种或者两种以上的细胞因子，能够包被两种抗体以捕获两种细胞因子，然后用两种不同的酶联抗体以及显色剂显出两种斑点来。早在1988年，CecilC.Czerkinsky就提出并且实现了这种想法（CzerkinskyCet.al,.1988b）。但是，双色ELISPOT有一种与生俱来的弱点，那就是斑点分离的问题。大家懂得，斑点的混合色属于物理学上“颜料的三原色”问题，两种不同颜色的颜料如果以不同的比例混合，会出现一系列不同的表观颜色。其中的细微差别，人的肉眼有时候都难于判断，何况是自动的读板仪。因此，在双色ELISPOT斑点识别上，总会有些混色的斑点无法对的的识别与分类。为理解决这个难题，人们想到了用荧光元及检测ELISPOT的办法（RuedlCet.al.,1994;SarawarSRet.al.,1994）。不同颜色的荧光混合在一起，只要加一张滤光片，就能够精确的滤出目的荧光，而遮蔽掉其它颜色的荧光，荧光之间能够互不干扰。这对于双因子，甚至多因子ELISPOT检测都是十分抱负的手段（GazagneAet.al.,）。但是荧光ELISPOT检测现在尚有局限性之处。由于荧光素直接偶联在抗体或者亲和素上，缺少酶催化底物的那种放大作用，因此敏捷度还无法和化学显色的ELISPOT办法比较（GazagneAet.al.,）。另外，硝酸纤维素膜本身在激发下就会发荧光，因此不适合做荧光ELISPOT底板材料。PVDF膜也有本身发荧光的问题，即使不像硝酸纤维素膜那样严重，但是也会造成背景升高，信噪比下降的问题（GazagneAet.al.,）。荷兰U-Cytech公司已经发开出了新一代的荧光底板介质Hydrogel™，它现有很高的抗体吸附性质，又没有荧光背景。Hydrogel™现在存在的唯一问题是保存起来不够稳定，限制了它的推广。总而言之，多细胞因子检测是ELISPOT将来的一种发展方向，但在技术上还不够成熟，有待于改善。二、

ELISPOT的办法由于有商品化的试剂盒，ELISPOT操作本身已经大大简化。现在的ELISPOT试剂盒按抗体的包被状况分为已包被板的和未包被板的两类。前者实验操作简朴，但是背景较高，且价格较贵，因此应用不如后者广泛。按照ELISPOT底板材料分，能够分为PVDF膜板和非PVDF膜板。PVDF板由于疏水性的问题，需要用乙醇预先润湿，在洗涤过程中也更复杂某些。各个公司的试剂盒使用起来大同小异，我们以荷兰U-Cytech公司的PVDF板IFN-γ试剂盒威力，列出其操作办法。1.

实验的准给工作1)

设备与耗材：1.

超净工作台；2.

5%CO2

37°C细胞培养箱；3.

P20,P200,P1000微量移液器；4.

P3008通道微量移液器，P30012通道微量移液器；5.

BiosysELISPOTReader6.

P20,P200,P1000枪头；7.

多道移液器吸槽；8.

0.5mL,1.5mLEP管。2)

溶液配制PBS:用分析纯试剂，Millipore级别的纯水配制，高压灭菌。PBST:PBS加入0.05%Tween-20，注意无菌操作。储存于20-25°C，可寄存一种月。70%乙醇：分析纯乙醇70mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。30%乙醇：分析纯乙醇30mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。包被抗体（coatingantibody，Primaryantibody）：照U-Cytech阐明书，加入双蒸水溶解。使用时，用PBS稀释50倍，每孔50μL。封闭液：用PBS将试剂盒中的封闭存储液（BlockingstocksolutionR）稀释10倍，每孔200μL。抗体稀释液：注意，只是用来稀释检测抗体和酶联亲和素。用PBS将试剂盒中的稀释存储液（DilutionbufferR）稀释10倍检测抗体（Biotinylateddetectorantibody，Secondaryantibody）：照U-Cytech阐明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。酶联亲和素（Streptavidin-HRPconjugate）：照U-Cytech阐明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。AEC显色液:照U-Cytech阐明书，用100mL30%乙醇溶解底物缓冲液胶囊（Substratebuffercapsule），然后加入3.3mLAEC储存液（AECstocksolution），混合均匀后10mL每支分装，-20oC保存。使用时，解冻，每孔加入100μL。PHA刺激物:将储存液(2mg/ml,Murex)分装成20μL/EP管，-20°C长久冻存。使用时，加入980μLU-Cytech无血清培养基（或者1640基本培养基），成为工作液（40μg/mL，10倍终浓度），每孔加入10μL，终浓度4μg/mL。U-Cytech无血清培养基：我们推荐无血清ELISPOT技术，它能排除血清的干扰，成果更加稳定可靠，背景也更加好。如果没有，能够用含10%血清的1640培养基替代。2.

ELISPOT原则操作程序1)

第一天：ELISPOT包被程序1.

设计好实验，把每个孔要加入的内容做成卡片，届时候就会从容诸多。2.

每孔加入15μL70%的乙醇预湿30秒。注意：未润湿的PVDF膜是洁白的、不透明的，通过乙醇润湿之后，颜色变暗，变成半透明状，很容易观察两者的区别。加乙醇的时候，枪头应当靠在孔壁靠近孔底的地方，注意枪头不到刺到PVDF膜。有时候，加入的乙醇挂在孔壁上，这时要盖上板盖，轻轻叩击，让乙醇顺势滑落。乙醇一旦接触到PVDF膜，就会在表面张力和毛细作用之下快速浸润整块膜，使得膜的颜色和透明度发生变化。15μL是通过优化的体积，它能确保刚好完全浸润整块膜，而不会有剩余。如果加大使用量，乙醇溶液就会透过膜而积存在膜的背面，加深实验的背景。3.

加入100μL去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留。4.

按照试剂盒的使用阐明，将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中，每孔加入50μL，4°C包被过夜。5.

（次日）倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。6.

加入200μL试剂盒自带的稀释好的封闭液，37°C封闭1小时。7.

倾倒封闭液，不必洗涤，直接能够进行细胞培养。（也能够用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次，拍干，封口，4°C保存，能够在4°C保存数周。）2)

第二天：铺细胞,加入刺激物，培养整个实验设立一组正对照（PHA刺激），每一种细胞样品（同一种捐献者或者实验动物）要设一种负对照（不加刺激物），整块板还要加一种背景负对照（不含细胞，只加培养基和全部的检测试剂）。1.

填好实验卡片，用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一种细胞/刺激物的组合设立2-4个孔的重复（想要有统计学的意义，每个细胞/刺激物设4个孔的重复）。2.

取出封闭好的板，准备加入细胞。如果是以前做的封闭，能够加入200μL的U-Cytech无血清培养基，室温静置10分钟，倾倒，然后再重复一次。3.

按照实验卡片的安排，加入不同浓度的细胞，100μL/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀（要诀是加入细胞之后，不要再震动或者拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散，实际状况刚好相反）。正对照的细胞浓度为1x105/well，实验组的样品细胞浓度请自行调节。4.

加入100μL的U-Cytech无血清培养基到背景负对照孔。5.

正对照孔加入10μLPHA，终浓度4ug/mL，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。6.

加入实验者自己的刺激物（配制成10X终浓度，10μL/well）到实验孔。加完刺激物之后不要再拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让刺激物在孔中混合均匀，事实上，通过扩散，刺激物也会很快混合均匀。拍击板子会让细胞成圈的分布在孔的外周。7.

当加完全部的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37°C培养18-24小时。注旨在整个培养过程中避免移动、碰撞培养板。为了获得更加好的成果，甚至开关培养箱的箱门也应当严禁。由于碰撞会造成细胞的移位，造成斑点的含糊、拖尾。3)

第三天：培养后操作1.

倾倒孔内的细胞及培养基。2.

低渗法将细胞裂解，每孔加入200μL冰冷的去离子水，将板置于冰上冰浴10分钟。3.

每孔用200μLPBST洗涤10遍，洗涤最后一遍之后，将板倒扣在吸水纸上拍干。4.

按照试剂盒阐明的浓度，用抗体稀释液稀释检测抗体，每孔加入100μL生物素标记的检测抗体，37°C1小时。5.

每孔用200μLPBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。注意：洗涤膜的背面，我们探索出的方法是，在一种浅托盘中盛上干净的PBST，将膜板的底面浸入，轻轻摇晃几次即可。注意，一定要将膜的背面和塑料保护层上的液体甩干之后，再合拢，盖上，不要伤害到膜。6.

按照试剂盒阐明的浓度，用抗体稀释液稀释酶标的链霉亲和素，每孔加入100μL，37°C1小时。7.

每孔用200μLPBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。8.

照试剂盒的阐明，解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100μL的显色液，室温静置20-30分钟，注意避光。9.

待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30分钟，让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内，避免膜发脆、破裂。10.

将ELISPPOT板置于BiosysBioreader4000PRO自动读板仪内，调节好适宜的参数，半点计数，并统计斑点的多个参数，作统计分析。三、

ELISPOT检测的原则化与质量控制由于ELISPOT检测的超高敏捷度，它的斑点形成容易受到诸多因素的影响。如果不采用方法，检测的重复性很难确保，不同实验室、不同操作者、甚至同一操作者不同批次之间的成果也很难进行直接比较和汇总。1.

ELISPOT技术的原则化为了提高ELISPOT检测成果的可重复性，增加实验的可信度，必须建立一套原则化的实验操作规范（JanetzkiSet.al.,）。原则化的实验操作规范不仅仅是某些实验操作，更是一种系统工程，需要提高到实验室管理与制度架构上来建设。这涉及实验室制度的建立，实验人员的培训，实验程序的建立和原则化，实验设备、试剂、耗材的选择与原则化等等。单就实验流程而言，原则化规范从实验样品的采集阶段就开始了，始终延续到整个实验的结束，即数据分析解决的完毕（JanetzkiSet.al.,）。影响到ELISPOT斑点频率的因素诸多，但是最重要的影响因素能够归结为三个：其一，被检测细胞的状态；其二，整个实验过程中细胞所接触到的内毒素以及其它敏感成分；其三，刺激物的质量与纯度。1)

细胞状态这是一种很难量化的主观概念。尽管量化困难，但是长久做ELISPOT检测的实验者都能够感觉到：但凡状态好、活力高、功效保持完好的细胞，ELISPOT检测时必然背景干净，负对照斑点少，实验组的斑点圆润美丽，并且成果的可重复性好，数据真实可信。反之亦然。如何保持细胞的良好状态呢？根据不用的状况有不用的应对方法。做ELISPOT检测的细胞能够分为两类，一类是新鲜分离的细胞，尚有一类是通过冻存复苏的细胞。对于前一类细胞，为让细胞始终处在最佳的状态，需要采用通过优化的、原则化的细胞分离办法，经量减少机械损伤（例如通过机械办法将小鼠的脾脏分解成单个细胞）和有毒的化学物质（例如淋巴细胞分离液）对细胞的损害。而对于冻存复苏的细胞，状况就更加复杂了。冻存与解冻对细胞本身就是很大的伤害。在细胞冻存中还会使用某些保护剂（例如DMSO），能减少冻存对细胞的伤害，但是这些保护剂本身就含有生物毒性，也会伤害细胞，影响细胞的状态。可是说，ELISPOT技术对细胞的冻存与复苏提出了更加严格的规定，不单单规定细胞的存活率高，还规定细胞的免疫功效在冻存前后不发生变化。因此，传统的细胞冻存、复苏办法已经不能适应新的规定了。国外较早开展这方面的研究，从理论与实践上已经探索出了一套行之有效的适应ELISPOT功效检测规定的细胞冻存、复苏办法，能够确保很高的存活率（90%），并且斑点形成细胞SFC频率保持不变（MaeckerHTet.al.,）。有些公司已经把细胞冻存、复苏程序通过优化而固定下来了，还开发了对应的细胞冻存液，能够对细胞提供额外的保护。例如荷兰U-Cytech公司推出的冻存液，专门针对做ELISPOT检测的细胞，辅以原则化的冻存、复苏程序，效果卓越。2)

内毒素内毒素，即使是很低的浓度，也能够非特异性的刺激T淋巴细胞，使其分泌细胞因子。因此它对ELISPOT斑点频率有着非常大的影响。控制ELISPOT检测中的活细胞所接触到的内毒素，要从各个关口严格控制。最先控制的是ELISPOT试剂，要选择口碑好的、产品内毒素含量低的产品。另首先要控制培养基和血清。最佳选购低内毒素的产品，每一批次要做验证。最后，要控制整个实验操作，做到严格无菌。特别指出的是血清，除了含有内毒素，会增加负对照的斑点数目之外，还可能含有其它未知ELISPOT敏感成分，或者增加或者克制斑点的生成。这在以往的报道中已经屡见不鲜。为了彻底解决这一问题，最佳采用无血清ELISPOT技术。即在ELISPOT刺激孵育中使用不含血清的培养基。现在，合用于人的PBMC细胞的无血清培养技术已经成熟，荷兰U-Cytech公司开发了专门针对于人的PBMC细胞的ELISPOT无血清培养基，化学成分完全限定，和ELISPOT兼容，完全消除了血清对检测的干扰作用。3)

刺激物。选择特异性的刺激物，有一种原则，那就是：成分尽量简朴，纯度尽量高。全部首推T细胞表位肽。它的成分简朴，特异性也最佳。但是由于涉及到MHC分子类型匹配的问题，如果不懂得实验对象的MHC类型的话，可能要多选择几个T细胞表位肽，验证明验效果。另首先推荐重叠多肽池。如果没有抗原蛋白的T细胞表位信息，也无对应的文献能够参考，那最佳选择重叠多肽池。现在的生物信息学有了长足的发展，能够帮我们预测蛋白质序列上潜在的T细胞表位肽，根据预测的成果，在潜在的T细胞表位肽附近和成一系列的重叠多肽，混合成多肽池，也能对特异性的细胞免疫反映作出有效刺激。以上两类多肽都是人工合成的，特别要注意合成的纯度（最佳在90%以上，越纯越好）以及合成过程中的质量控制，注意避免内毒素的污染。再次一级的刺激物是重组蛋白。注意，在大肠杆菌中重组体现的蛋白质完全不可用。由于它含有的大肠杆菌成分以及内毒素高到让人无法接受的水平。最佳是选择在哺乳动物细胞中体现的蛋白质，它与ELISPOT的相容性最佳。昆虫杆状病毒载体体现的蛋白纯度比较高，也能够使用。如果使用酵母载体体现的蛋白，需要多做验证，有时候效果也会比较好。如果实在没有方法获得化学成分单一且已知的抗原刺激物而被迫使用成分未知的提取物的话，一定要注意多做验证，多做对照，多做重复孔。普通来说，这类刺激物会产生诸多非特异性的斑点，在不同的实验对象个体之间会产生很大的差别，属于不得已而为之。2.

ELISPOT检测的质量控制仅仅只有原则化的操作规范，不同实验者、不同实验室的ELISPOT成果还无法直接互相比较。为了做到这一点，还需要有一种定量的质控系统。现在，在国际上的艾滋病疫苗项目需要在不同的国家、不同的实验是共同实施完毕。为了评定疫苗的效果，在做ELISPOT质量控制时，采用了核心参比实验室质控的办法（JanetzkiSet.al.,）。即让分布在各个地方的前线实验室将有代表性的样品细胞冻存，运输到核心实验室，核心实验室统一对代表样品做ELISPOT检测，以这个检测成果和各个实验室自己的实验成果作比较和校正，然后汇总校正过的全局实验成果。这种定量质控的方式能够称之为“收上来”的质控方式。尚有一种相对的定量质控方式。即在一种核心实验室制备号原则品（涉及原则刺激物和冻存细胞），然后分发到参加质量控制的各个前线实验室。各个实验在做ELISPOT检测的同时也顺带做上原则品的检测。如果原则品的实验成果在预先设定的范畴之内，那么前线实验室的该批ELISPOT检测成果就是可信的，可接受的。如果各个前线实验室的检测都以同一种原则品做质控，并且在质控范畴之内，那么这些实验室之间的ELISPOT成果就是能够互相比较的，能够共同参加实验数据的统计分析。ELISPOT数据解决与自动读板设备ELISPOT检测的最后数据是细胞频率，即在细胞群体中，受某种特异性抗原的刺激而分泌某种细胞因子的阳性细胞的比例。细胞的总数在一开始已经技术过了。需要统计的是阳性细胞（也称斑点形成细胞spotformingcellSFC）数目。根据以前的技术研究，我们能够必定，每一种ELISPOT斑点对应唯一一种阳性细胞。因此ELSPOT数据解决最重要的工作就是进行斑点计数。手工计数普通是使用双筒解剖镜，在放大25倍的解剖镜下，一种孔的底板刚好覆盖一种完整的视野。实验操作人员手持按压式的计数器，对孔内的斑点逐个计数。手工计数最大的优点就是能够运用人脑的智慧与经验：例如能够适应多个大小的斑点，排除多个假阳性的斑点，能识别复杂的背景下的含糊的斑点，等等。但是手工计数也有致命的弱点，那就是工作乏味，费时费力。特别是在实验规模比较大、斑点频率比较高的时候（例如有数快板，每孔有数百乃至上千个斑点），人工计数简直就是实验者的恶梦！另外，人工计数的主观差别也是一种问题，实验者很难在整个计数过程中保持完全相似的斑点鉴定原则。要实现这个过程的自动化，我们很容易想到显微摄影技术、图像解决技术以及计算机人工智能技术。把它们综合到一起，这就是ELISPOT自动读板设备。1992年，德国莱卡公司推出了第一台ELISPOT自动读板仪。然而市场却没打开，由于那时的ELISPOT技术还远远没有现在这样普及，对自动读板仪的需求还局限性以支撑起一种商业化的产品。四、

ELISPOT的应用与展望ELISPOT技术的独特优点已经让它在抗原特异性T细胞免疫学研究上独占鳌头。它是当今唯一能够检测到到百万分之一阳性细胞率的检测技术。如此高的敏捷度就连流式细胞技术（细胞内细胞因子染色）和tetramer技术也望尘莫及（LetschAet.al.,）。另外由于淋巴细胞的冻存复苏问题也得到了完美的解决，通过冻存复苏的细胞并不丧失免疫功效（MaeckerHTet.al.,；KvarnstromMet.al.,）。这一点对临床实验非常重要，它使科研人员得以并行分析免疫治疗前、后的病人血样。如果实验牵涉全国乃至全球多个临床实验机构，病人血样可冻存、运输到到核心实验室仪器检测。同理，一种实验样品或原则对照品可分装冻存，运输到不同的实验室检测，以资比较。因此，ELISPOT技术的应用在国外已经完全普及。但凡需要进行免疫学检测的地方机会都能够应用该项技术。粗略的划分能够分为下列几类：1.

疫苗研究开发ELISPOT检测已经成为评价疫苗细胞免疫反映最有效的指标（HarropRet.al.,）。我们懂得，疫苗的保护效果能够分为两部分：体液免疫保护和细胞免疫保护。有效的疫苗不仅能够激发强烈的体液免疫，也能激发有效的细胞免疫（HolmgrenJet.al.,1992b）。对于某些持续性感染的疾病，疫苗的细胞免疫保护效果甚至居于重要地位。最出名的例子是艾滋病疫苗开发（LeeFKet.al.,1989；StratovIet.al.,）。由于艾滋病毒的超级突变能力，体液免疫往往会被病毒容易逃避，体内真正控制病毒复制的因素是细胞免疫反映，即去除受感染的CD4+细胞（VahlneAet.al.,1991；MaeckerHTet.al.,）。除了防止性的疫苗开发之外，治疗性疫苗也是现在疫苗开发的重要构成部分。治疗疫苗的重要功效在于重新激发起人体内被克制的针对病源细胞免疫反映。现在的治疗仪表涉及乙肝疫苗、黑色素瘤疫苗（ZarourHMet.al.,）、肝癌疫苗（ChiKHet.al.,）、本身免疫疫苗等等。2.

临床指导许多疾病的发生、发展都是与人体的免疫系统异常有关联的。例如多个本身免疫疾病：I-型糖尿病（KarlssonFaresjoMGet.al.,），多发硬化症（MoldovanIRet.al.,）、系统性红斑狼疮（KalsiJKet.al.,）、牛皮癣/银屑病（SigmundsdottirHt.al.,1997）、结核病（R