3株木霉菌对人参锈腐病菌的拮抗作用

3株木霉菌对人参锈腐病菌的拮抗作用

人参的锈腐烂病是由真菌引起的。这是人参生产中最重要的疾病之一，严重影响了人参的质量和产量。传统上对人参锈腐病的防治一般采用化学防治,但由于大量化学农药施用使得人参不仅产量低、品质差,而且农药残留严重,直接影响其在国际市场上的竞争力。在国家GAP的要求下,研制药效持久且对环境无压力的微生物农药已成为药用植物病害防治新的发展方向,药用植物病害生防菌的筛选也就得到了广泛关注。木霉菌作为一种有效的生防菌,广泛存在于土壤中,具有生存能力强、适应性广、能够拮抗多种病原真菌等优点,越来越受到人们重视。本研究以人参锈腐病菌为靶标菌,从79株木霉菌株中筛选出具有高抑菌活性的3株菌株,并就其对3种常用杀菌剂的耐药性进行测定,最终筛选出1株具有生防利用潜力的菌株ECT-01,为药用植物病害生防菌的进一步研究与利用奠定了基础。1材料和方法1.1供试菌种及药剂供试靶标菌:人参锈腐菌(Cylindrocarpondestructan),由沈阳农业大学植物保护学院植物病害流行实验室保存。供试生防菌:79株木霉菌(Trichodermaspp.),分离自辽宁药用植物种植基地根际土壤中。供试杀菌剂:50%多菌灵可湿性粉剂(江阴市农药二厂有限公司);95%恶霉灵原药(北京北农绿亨科技发展有限公司);75%百菌清可湿性粉剂[先正达(中国)投资有限公司]。1.2抗木霉菌和菌株的筛选1.2.1菌株单孢分离将79株木霉菌菌株活化后打取菌片(直径为4mm),在PDA培养基上生长,3d后长势较快的菌株进行单孢分离,其余菌株予以淘汰。1.2.2人参锈腐菌种的接种采用对峙培养法,用打孔器自培养5d的供试木霉菌和人参锈腐菌菌落边缘打取直径4mm的菌块,分别接种在平板上相对的两侧,相距4cm,倒置,25℃恒温培养,以只接种人参锈腐菌为对照。每处理重复3次,每隔12h观察1次,5d后按以下公式计算抑制率:抑制率=(对照半径-处理半径)/(对照半径-菌碟半径)×100%。1.3生长处理工艺中人参锈腐菌的生长参考高克祥等的方法,将木霉菌和人参锈腐菌相对接种在加有一薄层灭菌PDA培养基的无菌载玻片上放入培养皿中,25℃恒温保湿培养,待木霉菌菌丝和人参锈腐菌菌丝接触后,取出载玻片,在光学显微镜下观察对峙培养交界处的菌丝形态。1.4木霉菌对平板的生长采用生长速率法,经预试验后将不同药剂分别按不同浓度与溶化的PDA培养基混匀制成含药培养基平板,分别于平板中央接入直径4mm的木霉菌菌片,25℃下培养,以不加药的PDA平板为对照。待对照菌丝长满培养皿时调查菌落直径、计算菌落生长抑制率,将抑制百分率换算成抑制几率值,以浓度对数为横坐标,抑制几率值为纵坐标,作回归直线,求出回归方程及有效中浓度(EC50)。2结果与分析2.1生长速率及抑制率从药用植物土壤中筛选出的79株木霉菌经过初筛,获得33株生长速率较快的木霉菌株,纯培养时均可在96h内长满培养皿。利用对峙培养法进行复筛,测定33株木霉菌对人参锈腐菌的抑制率。120h后对人参锈腐菌抑制率达到70%的有3株,70%～60%之间的有24株,低于60%的有6株。其中ECT-01、WWZ22-11和2-673株木霉菌生长速率较快,36h与人参锈腐菌菌落接触,并能在60h内迅速包围人参锈腐菌菌落,在菌落上产生大量孢子,对人参锈腐菌菌落生长的抑制率分别是77.24%、76.08%、74.06%。根据以上结果,进一步对ECT-01、WWZ22-11、2-673株木霉菌与人参锈腐菌的菌丝相互作用进行观察。2.2木霉菌对人参锈腐菌生长和产孢量的影响对峙培养中,可观察到3株木霉菌与人参锈腐菌之间的相互作用。在接种后36h内,3株木霉菌均可与人参锈腐菌的菌丝发生明显的接触,随后木霉菌或者覆盖或者侵入人参锈腐菌菌落,抑制人参锈腐菌菌落生长,最终使其菌落逐渐萎缩,木霉菌菌丝布满整个培养皿,占领全部的营养空间,并在人参锈腐菌菌落上产生孢子,但3株木霉菌中WWZ22-11产孢量较低。通过显微观察发现,3株木霉菌菌丝对人参锈腐菌菌丝的作用方式不同(表1),如ECT-01与2-67对人参锈腐菌菌丝的作用方式较复杂(图1),主要通过缠绕、侵入、穿透菌丝、吸附在菌丝上以及与人参锈腐菌菌丝平行生长,来吸取人参锈腐菌菌丝养分,最终使人参锈腐菌干枯解体,直至死亡。其中2-67能够产生侵入钉侵入病原菌菌丝内部吸收营养。WWZ22-11对人参锈腐病病原菌菌丝的作用方式较简单,主要通过缠绕和平行生长的方式,寄生于人参锈腐菌菌丝上。2.3株木霉菌对百菌清的耐药性杀菌剂对木霉菌的抑制作用随药剂施用浓度的增大而逐渐增强(表2),筛选出的3株拮抗木霉菌对多菌灵特别敏感,其中菌株WWZ22-11对多菌灵的耐药性相对较强,EC50为0.69mg/L;菌株ECT-01、2-67对多菌灵的耐药性较弱,EC50分别为0.30mg/L、0.33mg/L。百菌清浓度在100mg/L以上,3株木霉菌均能生长,但菌丝生长受到抑制,表现为菌落边缘致密,菌丝及菌落变形,3株木霉菌中ECT-01对百菌清的耐药性最强,EC50为2.8mg/L,WWZ22-11、2-67对百菌清的耐药性均较弱,EC50分别为0.46mg/L、0.45mg/L(表3)。恶霉灵对3株木霉菌的抑制作用较小,在浓度达到600mg/L时,3株木霉菌仍能生长,其中ECT-01对恶霉灵的耐药性较强,EC50为174.51mg/L,菌株WWZ22-11和2-67的EC50分别为121.61mg/L、165.30mg/L,表明恶霉灵在正常施用浓度下,对3株木霉菌生长的抑制作用极其微弱(表4)。3株网络霉菌对人参锈腐菌的抗性检测木霉菌是广泛存在于土壤和植物根系中的一类微生物,从20世纪30年代Weindling第一次发现木素木霉菌(Trichodermalignorum)可以寄生于多种植物病原真菌以来,一直被作为理想的生防菌而得到广泛的重视。木霉属的某些种用于防治尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、整齐小核菌等病原菌引起的农作物病害已有报道,但用于药用植物病害防治的研究较少。本试验以人参锈腐病病原菌为靶标菌,利用生长速率法、平皿对峙法,从79株木霉菌株中筛选出3株拮抗效果较好的菌株ECT-01、WWZ22-11、2-67,3株木霉菌对人参锈腐菌抑制率分别达到77.24%、76.08%、74.06%。通过对其拮抗机理的初步研究发现,在接种后36h内,3株木霉菌均可与人参锈腐菌的菌丝发生明显的接触,随后木霉菌或者覆盖或者侵入人参锈腐菌的菌落,抑制菌落生长,最终使人参锈腐菌菌落逐渐萎缩。通过显微观察进一步发现菌株ECT-01、2-67的菌丝对人参锈腐菌的作用方式较复杂,主要通过缠绕、平行生长、侵入、穿透等方式作用于人参锈腐菌菌丝上,同时发现菌株2-67存在侵入钉结构;菌株WWZ22-11的菌丝对人参锈腐菌的作用方式相对较简单,只观察到了缠绕和平行生长的现象,与高克祥等观察到的木霉菌重寄生作用种类相符,但未发现附着孢或钩状分枝,说明木霉菌菌株ECT-01、2-67对人参锈腐菌菌丝的重寄生作用明显高于WWZ22-11。近年来,高效杀菌剂的大面积高频率施用,不仅使病原菌产生了抗药性,还大量残留在土壤中,严重威胁到有益微生物的生存。筛选出的3株人参锈腐病拮抗菌木霉菌