棉花黑斑病的病原分离及其致病力分析

棉花黑斑病的病原分离及其致病力分析

黑棉病是世界上广泛传播的一起的一般棉叶侵蚀性疾病。也被称为纤维环病，俗称腰痛，发生在棉花、真叶和幼苗时期。它的病原体为半知菌亚门大链格孢属真菌,被称为棉花轮纹菌或棉花黑斑病菌。它是棉花苗期叶部病害中分布最广、流行面积最大、流行频率最高的病害,阴湿多雨年份往往猖獗流行,给棉花生产造成毁灭性灾害。棉花黑斑病的病原菌有多种,其中以大孢链格孢菌(A.macrosporaZimm.)、细极链格孢菌(A.tenuissimaWiltsh.)、棉链格孢菌[A.gossypina(Thum.)Hopk.]、细交链孢菌[A.alternata(Fr.)Keissl.]等为常见种。不同病原菌间致病力不同,大孢链格孢菌致病力最强。目前,棉花黑斑病病原菌研究多集中在发病条件和化学防治方面,对其病原菌的鉴定及生物防治报道较少,还没有关于河南地区棉花黑斑病病原田间致病力和生物防治的研究报道。本研究从河南省部分地区感染黑斑病的棉花叶片上采集并分离病原菌,并对其致病力、病原及其生防木霉进行了研究,以期为棉花黑斑病的生物防治奠定理论基础。1材料和方法1.1材料表面棉花黑斑病菌由本课题组分离。哈茨木霉菌菌株TA、TD、TG、TH、TI、TM及TX,由浙江大学徐同教授馈赠。供试棉花品种为新植1号。1.2健白醋的消毒从洛阳、三门峡、周口市和河南省农业科学院的田间采集发病较重且症状典型的棉花叶片,取病健交界处组织,先用体积分数为75%的乙醇消毒30s,再用质量分数为1%的NaClO消毒5min,用无菌水清洗。消毒后的组织块置于PDA平板培养基上,25℃恒温培养2d,长出真菌菌落后挑取边缘菌丝单孢纯化,分离纯化得到的菌株接种到PDA斜面培养基上。1.3分生孢子形态观察分离纯化后的菌落产孢后,挑取少量菌丝和分生孢子,观察菌丝及分生孢子形态,测量分生孢子的长、宽、分隔数及孢子梗的有无、长短,每个处理至少测量30个孢子,并对照文献进行形态鉴定。1.4织物前织物中前培养液浓度的确定幼苗4~5片真叶时,用灭菌后的蒸馏水将枝条及叶片冲洗干净,再用湿润纱布轻搓叶片表面,去除表面蜡质。采用喷雾法将孢子悬浮液均匀喷洒在叶片表面,病原菌孢子悬浮液浓度为108个/mL,以清水作对照。重复3次,每重复20株。将处理后的棉花植株放入人工气候箱中,并用塑料袋将整株罩住。温度、相对湿度、光照时间分别设置为29℃、90%和15h。14d后调查发病情况,统计病情指数。病情分级:0级,无病症;1~5级分别为病斑占叶片表面积的0~20%、21%~40%、41%~60%、61%~80%和81%~100%。病情指数=[∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)]×1001.5pcr反应体系及程序以CTAB法提取病菌总DNA。rDNA-ITS扩增选用的引物为ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG-3’)。PCR反应体系含DNA模板1.00μL(约10ng)、10×缓冲液(1000mmol/LTris-HCl,500mmoL/LKCl)2.50μL、Mg2+(25mmoL/LMgCl2)1.80μL、dNTP(2.5mmol/Leach)2.50μL、引物(2μmoL/L)各1.00μL、Taq酶1.25μL,加ddH2O至25.00μL。反应程序为:94℃预变性2min;94℃变性40s,54℃退火40s,72℃延伸40s,共35个循环;72℃延伸10min。反应产物在质量浓度1.2%琼脂糖凝胶上电泳检测(120V,30min)。扩增的PCR产物委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序。1.6病原菌抑菌率测定采用对峙培养法。木霉菌和病原菌CHB-3于28℃活化3d。挑取直径5mm的病原菌菌块,接种到新制PDA平板左侧,再将木霉菌块接种到平板右侧。以只接种病原菌平板作对照,每处理3次重复。28℃恒温培养6d,每天记录病原菌落指向木霉菌半径以及对照病原菌菌落半径,计算抑菌率。抑菌率=[(病原菌对照菌落半径-病原菌落指向木霉菌半径)/病原菌对照菌落半径]×100%拮抗系数的分级标准(5级):Ⅰ级,木霉菌丝占平皿面积的100%;Ⅱ级,木霉菌丝占平皿面积的2/3以上;Ⅲ级,木霉菌丝占平皿面积的1/3~2/3;Ⅳ级,木霉菌丝占平皿面积的1/3以下;Ⅴ级,病原菌丝占平皿面积的100%。1.7处理数据应用DPSv7.05软件进行数据分析,采用邓肯氏法进行差异显著性检验。2结果与分析2.1病原菌子不能再诱导从采集到的标本中共分离到5株病原菌,分别编号为:CHB-1、CHB-2、CHB-3、CHB-4、CHB-5。将病菌孢子悬浮液喷洒于健康叶片,接种48h后部分植株叶面出现红褐色小圆斑,以幼嫩叶片为主。此后病斑逐渐明显,扩展成不规则形至近圆形褐色斑,清水对照未发病。接种后第六天计算不同菌株的病情指数,结果表明不同菌系之间的致病力存在极显著差异,CHB-3的致病力比较强,病情指数达到89.3(表1)。2.2菌落生长后期在PDA培养基上接种病原菌后,菌丝呈放射状向外生长,后呈圆形,边缘整齐。菌落淡褐色,生长茂密,没有气味。菌落生长后期,有明显环状轮纹,背面中心有褐色代谢产物产生(图1)。分生孢子倒棍棒形,部分孢子卵圆形或倒梨形,基部圆,暗褐色,嘴孢短,成串着生,有横隔1~9个,纵隔0~6个,隔膜处缢缩,大小12.5~42.5μm×6.0~12.5μm。根据形态学数据将CHB-3初步鉴定为半知菌亚门,丛梗孢目,暗色孢科,链格孢属真菌。2.3pcr扩增结果以病菌总DNA为模板,用通用引物ITS4和ITS5分别对致病力较强的CHB-2、CHB-3、CHB-5菌株的ITS区段进行扩增和序列测定,拼接后分别得到长度为596、585、574bp的序列。采用DNA-MAN5.2.2软件对测得的rDNA-ITS序列进行比对,发现这3株真菌的ITS序列完全相同。通过Blast搜索,发现与所测菌株的rDNA-ITS序列相似率为100%的序列(表2)中,有4个来自细极链格孢(A.tenuissima),5个来自烟草赤星病菌(A.alternata),5个来自链格孢属真菌(A.sp.),4个来自未鉴定的子囊菌,1个长柄链格孢(A.longipes)和1个苹果轮斑病菌(A.mali)。根据棉花病株症状及病菌的形态特征,结合rDNA-ITS序列分析,所分离的棉花黑斑病病原菌鉴定为细极链格孢(A.tenuissima)。2.4对养殖受害者的抑菌对峙培养2~3d木霉菌即表现出对病原菌CHB-3的抑制作用。培养4d后木霉菌与病原菌接触,木霉菌和病原菌之间形成了较明显的抑制圈,大部分木霉菌在与病原菌的对峙中形成了对抗生长局面。随着时间的推移,被包围的病原菌有些边缘塌陷,菌落背面褐色加深,生长受到抑制。培养到第六天时与枯萎病菌形成了明显的抑菌圈。其中TA和TH菌株覆盖或侵入了黑斑病菌CHB-3菌落,拮抗作用较强(图2)。各菌株对棉花黑斑病菌CHB-3的抑制作用存在差异,当木霉菌接种6d时,对病原菌的抑菌率在56.7%~88.6%之间。其中木霉菌TH对黑斑病菌CHB-3具有较强的抑制作用,抑菌率为88.6%,拮抗系数为Ⅰ~Ⅱ级;TA菌株的抑菌效果次之(表3)。3不同药剂对棉棉病防治效果的影响黑斑病是棉花苗期叶片病害中分布最广,危害最大,流行频率最高的一种毁灭性病害,在我国主要产棉区都有发生,尤其是北方棉区,在阴湿多雨年份极易发生流行。对棉花黑斑病的研究主要是利用化学杀菌剂和预处理非致病性生防制剂。Shtienberg等的研究表明,系统性杀菌剂(戊唑醇)和保护性杀菌剂(代森锰)对棉花黑斑病均具有较好的防治效果,不同杀菌剂对碧玛棉产量和生长没有显著影响,但系统性杀菌剂在抑制已感染病害上具有更好效果。Jabaji-Hare等研究了非致病性的双核丝核菌和苯并噻二唑(BTH)对棉花黑斑病的防治效果,结果表明非致病性的双核丝核菌防病效果要优于BTH,且两者在抗病中具有协同作用。本研究进行了棉花黑斑病病原菌的分离、形态鉴定,并基于rDNA-ITS序列进行了分子鉴定,并首次利用哈茨木霉对其进行了室内抑菌研究。木霉菌是重要的植物病害防治菌,它可通过重寄生、抗生溶菌作用、竞争作用、诱导抗性及促进植物生长等机制抑制真菌病害。本试验研究了7个哈茨木霉菌株对棉花黑斑病病原菌的拮