药用植物木霉对2种病原菌的拮抗作用

药用植物木霉对2种病原菌的拮抗作用

四川、云南、贵州等省的特产。在四川,主产在彭州、郫县、什邡等地,为主要道地药材之一。根腐病是川芎生产上的重要病害,田间发病率通常在10%左右,严重者可达30%以上,给川芎生产造成严重损失。对川芎根腐病的防治,一般有农业防治和化学防治两种方法。农业防治是通过深耕翻土,开沟排水或进行水旱轮作、选择健壮苓种等措施进行的;化学防治则采用多菌灵等化学农药进行浸种或拌种。这些防治方法不仅复杂,而且见效慢;化学农药防治不但污染环境,防效也较差,不利于无公害药业生产的发展。随着可持续农业和可持续植物保护观念的不断深入,运用生物防治手段控制植物病害已越来越受到世界各国的重视,植物病害的生物防治被认为是具有发展潜力的研究领域,因此寻求有效的生物防治措施成为川芎生产可持续发展的需要。本项研究从生长在不同生态环境的中药材根际土样中分离筛选出了一批木霉菌株,并进行了室内拮抗试验和田间防病增产试验,现将结果报道如下。1材料和方法1.1田间病害调查2002～2004年期间,每年12月至次年5月的川芎根腐病发生期,在四川省彭州、郫县等地,采用随机取样方法调查川芎根腐病的田块发生率,采用5点取样方法调查病株率。观察记载川芎根腐病株的植株及叶片生长情况,取病株和健株的地下部分,观察其根部生长状况、根内外部有无变色等。1.2四川省根腐病病原体及繁殖特性将田间采集的病株在室内进行病原菌的分离与纯化,通过病原菌在PSA培养基上的培养性状、孢子的形状和大小等进行鉴定。1.3植物根际距表土土壤取样2002～2004年在四川省彭州、郫县等中药材种植地,选择不同生态环境药用植物根际距表土5～10cm土层土壤取样,装袋编号。木霉的分离采用稀释平板法。将土样用清水稀释制成1×10-3浓度的土壤悬浮液,接种于平板后,置25℃培养3d,按常规方法分离出木霉,并进行纯化培养,并根据培养性状进行鉴定。1.4病原菌抑菌活性测定供试病原菌为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和茄腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)。将分离获得的优良菌株哈茨木霉T23和供试病原菌,在PDA平板培养基上28℃培养3d,分别用打孔器打取直径5mm的菌丝块,将病原菌和木霉菌同时接入直径9cm的PDA培养皿内,两者相距5.0cm,对照只移植病原菌不移植木霉,设3次重复。将培养皿置于28℃培养箱中,72h后,观察抑菌效果,测量病原菌菌落直径,计算抑菌率。同时挑取两菌落交界处的气生菌丝,在光学显微镜下观察。抑菌率(%)=[(无木霉菌下病原菌菌落直径-有木霉菌下病原菌菌落直径)/无木霉菌下病原菌菌落直径]×100%。1.5处理方法及处理试验在四川省彭州市敖平镇进行,川芎于2003年8月15日移栽。栽培规格为:行距0.34m,窝距0.2m,种植密度为150000株/hm2。将哈茨木霉菌株T23、T158分别制备成为生防制剂,试验设置T23制剂每公顷施用3750g、7500g两种处理,T158制剂每公顷施用3750g、7500g两种处理,同时设置对照药剂50%多菌灵可湿性粉剂每公顷施用7500g处理,以及不施药的空白对照。木霉和多菌灵均在川芎移栽时按施入移栽窝内。各处理随机排列,重复3次,小区面积为20.0m2。每小区5点取样,每点调查0.67m2的所有植株,在2004年川芎根腐病发生盛期的5月25日调查各处理川芎根腐病发生情况(表1),计算病株率、病情指数和防治效果,并在川芎收获期测定每小区川芎鲜重产量。病株率(%)=(病株数/调查总株数)×100,病情指数=[Σ(各级病株数×相应级别)/(调查总株数×9)]×100,防治效果(%)=[(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数]×100。2结果与分析2.1下茎的生长与形态川芎根腐病的危害症状:川芎根腐病在川芎生长的整个生育期均可发生,4月中下旬至5月下旬进入盛发期。川芎植株发病后,地上部从外围的叶片开始褪色发黄,并逐渐向心叶扩展,最终凋萎;地下块茎(早期为苓种)的病部呈褐色至红褐色,发干,部分变为水渍状,然后内部坏死。若遇天气潮湿多雨,常变为湿腐,根茎迅速腐烂,甚至无法从土中拔起。病株的一般生长明显迟缓,长势较弱,根较小。到后期,整个植株完全停止生长,枯死,块茎腐烂。川芎根腐病的发生情况:2002～2004年期间在四川省彭州、郫县等地的川芎田块调查表明,在43块调查田块中,有31块田发生川芎根腐病,有病田块率达72.09%,川芎根腐病在田间的发病株率一般为8.25%～19.23%,平均为15.22%,重病田达54.17%,严重影响到川芎的产量和品质。2.2茄腐皮镰皮认识生长方向经分离鉴定,川芎根腐病是由尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum和茄腐皮镰刀菌Fusariumsolani两种病原菌复合浸染引起的。尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum在PSA上,气生菌丝体呈絮状,生长茂盛,菌落反面呈淡紫色至紫色。小孢子生于单茁瓶梗上,或有短的分生孢子梗,数量多,l～2个细胞,多呈椭圆形,大小:4.8～9.0μm×1.4～2.6μm,大孢子纺锤形至镰刀形,孢壁薄,两端尖,顶细胞稍呈钩状,有足细胞,大多3隔膜,极少4～5隔膜。茄腐皮镰刀菌Fusariumsolani在PSA上,菌丝体呈白色至淡紫色,生长较茂盛,絮状,菌落反面呈紫色。小分生孢子很多,生于单茁的瓶梗上,无色单胞,卵圆形至纺锤形,大小:6～15μm×2～4μm;大分生孢子生于具分枝的分生孢子梗上,产孢细胞瓶梗型,大分生孢子纺锤形,无色,稍弯,顶细胞稍尖,足细胞较钝,3～5隔膜,一般3分隔,少见5分隔。厚壁孢子较多,单生或多为2个串生,球形,淡黄色。2.3不同品种的树莓木霉菌的获得木霉广泛存在于药用植物根际土壤中,用稀释平板法共从32份土样中分离到24个木霉菌株。经鉴定表明,哈茨木霉(Trichoderma.harzianum)、桔绿木霉(T.citrinoriride)为主要种群。在获得的24个木霉菌株中,哈茨木霉13个,占54.17%;桔绿木霉6个,占25.00%;拟康氏木霉4个,占16.67%;其它木霉1个,占4.17%。通过室内初步筛选,获得对镰刀菌拮抗作用较强的菌株有哈茨木霉T23、T158和桔绿木霉T56等。2.4两种刀菌的生长抑制率不同菌株对尖孢镰刀菌和茄腐皮镰刀菌的拮抗效果差异较大,其中以哈茨木霉T23、T158的拮抗效果最强(表2)。对峙培养到第3d时,T23、T158菌株对尖孢镰刀菌生长抑制率分别为84.07%和83.47%;对茄腐皮镰刀菌的生长抑制率分别为78.83%和82.07%。随着培养时间的推移,病原菌菌丝生长受到明显抑制或停止,到第6d后全部被木霉菌丝所覆盖。取木霉与两种镰刀菌两菌落交界处的气生菌丝,在光学显微镜下观察可见,两种镰刀菌菌丝被木霉菌丝缠绕、寄生,病菌菌丝细胞变短,且病菌的孢子含量很少,而木霉的孢子量很大。说明木霉对两种镰刀菌的拮抗作用方式,在于营养和空间竞争、寄生两种形式。2.5对越界治病效果木霉对川芎根腐病具有较好的防治效果,哈茨木霉T23制剂、T158制剂的几种剂量处理均显著降低川芎根腐病的发生(表3)。其中,哈茨木霉T23制剂3750g/hm2、7500g/hm2对川芎根腐病的防治效果分别达56.89%、63.90%,哈茨木霉T158制剂3750g/hm2、7500g/hm2对川芎根腐病的防治效果分别为57.17%、59.73%,这4种处理均较化学农药多菌灵7500g/hm2的防治效果好。同时,木霉制剂处理还能显著提高川芎产量,哈茨木霉T23制剂两种剂量处理的产量达11925.0～12462.0kg/hm2,较空白对照增产12.49%～17.56%;T158制剂的两种剂量处理的产量达11050.5～11199.0kg/hm2,较空白对照增产4.25%～5.65%。3病料的微生物防治川芎根腐病是由尖孢镰刀菌和茄腐皮镰刀菌复合浸染引起的一种土传病害,发病一般从块茎开始,随后扩展到地上部,使叶片出现褪色发黄病斑。地下块茎的病部呈褐色至红褐色水渍状,严重者块茎腐烂。由于块茎表皮呈害色,表面多须根,难于观察块茎的病部症状,所以本试验在调查病害时,依据的是地上部叶片发病症状。川芎根腐病的病害分级标准尚未见文献报道,本文根据结合多年研究实践,采用0,1,3,5,7,9共6级的分级方法,能够较为准确地区分病株的发病级别,以及确定各处理的发病病情指数,具有一定的准确性和实用性。更为科学、准确的川芎根腐病病害分级标准,还有待于进一步研究制定。目前已发现很多微生物对植物病原菌具有抑制作用,木霉菌就是一类普遍存在并有重要经济作用的拮抗生物。有报道表明,木霉属中的某些菌株对立枯丝核菌、镰刀菌等具有较强的抗生活性,因而可用作生物防治的有益微生物。本研究将木霉作为生防益菌,以引起川芎根腐病的镰刀菌为防治对象,采用室内拮抗试验与田间试验相结合,筛选出的木霉菌株哈茨木霉T23、T158对川芎根腐病有显著的控制作用,培养制成的哈茨木霉T23制剂、T158制剂均能显著控制川芎根腐病的发生,制剂7500g/hm2对川芎根腐病的防治效果分别为63.90%和57.17%,优于目前常用化学农药多菌灵,显示了哈茨木霉T23、T158菌株在防治川芎根腐病方面的应用潜力。有研究表明,木霉菌对植物病原菌的作用有多种方式,主要包括竞争、寄生、抗生和溶菌等作用。本文研究的哈茨木霉T23、T158等菌株,能缠绕、寄生尖孢镰刀菌、茄腐皮镰刀菌的菌丝,使病