四环素族酶联免疫检测盒检测蜂产品中四环素族抗生素

四环素族酶联免疫检测盒检测蜂产品中四环素族抗生素

在验证和研究中，我们发现了一种使用酶联免疫法检测生奶牛中四环素（四环素、金霉素、土霉素）残留的四环素检测方案，该方案非常简单，希望能改进申请中四环素残留的测定，并通过实验证明其可行性。通常我们是用微生物杯碟法定量检测蜂产品中四环素族抗生素,需要2~3d,且结果大多为“未检出”。而用此酶联免疫检测方法可快速筛选出阳性或阴性样品,阴性样品可当天出结果,能节省大量阴性样品的定量检测时间,提高工作效率。阳性样品可用微生物杯碟法定量求出具体结果。另外还适用于蜂产品加工厂的原料筛选,提高出口蜂产品的质量。1材料和方法1.1试剂和材料试剂均为分析纯,水为蒸馏水,溶液指水溶液。1.1.1磷酸缓冲溶液pH4.0。用0.1mol/L的柠檬酸溶液加入0.1mol/L柠檬酸钠溶液中,调至pH4.0。1.1.2磷酸二氢钾溶液0.1mol/L,pH4.5。准确称取13.6g磷酸二氢钾于950mL水中溶解,用氢氧化钾调至pH4.5,加水至1000mL。1.1.3吸收树脂yad-2处理方法:用甲醇浸泡30min以上,然后用水以倾析法洗涤5~6次,浸泡于水中备用。1.1.4四环素检测箱利用酶联免疫原理检测四环素族的残留,由北京安普生化科技有限公司提供。1.1.5市场价格的纯牛奶高压灭菌121℃,15min,以保证牛奶中无四环素族残留。1.2浓缩器1.2.1离心轴:转速范围0~4000r/min。1.2.2旋转式真空浓缩器。1.2.3恒温水浴锅。1.2.4高压灭菌器。1.2.5氮气:纯度99.99%。1.2.6其他玻璃器皿。1.3样品溶液的提取1.3.1样品溶液的制备准确称取5.0g(精确至0.1g)蜂王浆于适当容器中,用80mL2%(W/V)三氯乙酸溶液分数次溶解。定量地移入离心管中,以2000r/min离心10min。将上清液移入250mL分液漏斗中。下层沉淀物再分别加入40、20mL2%(W/V)三氯乙酸溶液搅匀后离心,合并上清液于分液漏斗中。上述上清液分别用60、60和30mL乙醚振摇,提去癸稀酸,弃去上层乙醚,将下层水溶液收集于容器中,用40%(W/V)氢氧化钠溶液调节至pH4.5,用氮气流吹除样液中的有机试剂。将上述样液移入装有XAD-2树脂的层析柱中,以100mL/h的流速过柱,使样液中的四环素族被吸附。吸附后用200mL蒸馏水洗柱,流速控制为150mL/h。然后用90mL60%(V/V)甲醇溶液洗脱四环素族,流速为90mL/h,并用甲醇定容至100mL备用。1.3.2蜂王浆的制备准确称取50g(精确至0.1g)蜂蜜于300mL容器中,加入200mLpH4.0柠檬酸缓冲溶液,搅拌均匀,移入装有XAD-2树脂的层析柱中,以100mL/h的流速过柱,使样液中的四环素族被吸附。以下操作步骤与上述蜂王浆的步骤相同。收集甲醇洗脱液,并用60%(V/V)甲醇溶液定容至100mL备用。1.4测试1.4.1牛奶浆干酵母液准确吸取50mL蜂王浆甲醇提取液于梨形瓶中,在40℃减压浓缩至干后,准确加入2.5mL灭菌牛奶,使浓缩物被溶解。此样液中,相当于蜂王浆试样浓度为1.0g/mL。按四环素检测盒的使用要求,取试样进行检测。1.4.2牛奶样液的制备准确吸取10mL蜂蜜甲醇提取液于梨形瓶中,在40℃减压浓缩至干后,准确加入5.0mL灭菌牛奶,使浓缩物被溶解。此样液中,相当于蜂蜜试样浓度为1.0g/mL。按四环素检测盒的使用要求,取试样进行检测。1.4.3未检出tc族药物检测盒的检测结果为阴性时,可以结束试验,出具结果“未检出TC族抗生素”。检测盒的检测结果为阳性时,可出具阳性结果,或按照微生物杯碟法进行定量试验,得出试样中抗生素具体含量。2结果与讨论2.1加大加样回收教育制样这种四环素检测盒的灵敏度较高,检测精度为:四环素0.02mg/kg,金霉素0.03mg/kg,土霉素0.03mg/kg。每个检测盒带一套显色器、移液管及样品管,加样液量为450μL±50μL,一个检测盒用于一个样品,非常简单方便,但它是为牛奶中四环素族残留检测而设计的,在检测盒中直接加牛奶,10min后出结果,而改加入其他溶液,结果不理想。为此,我们在1.4.1和1.4.2中设计了用加热牛奶溶解浓缩物,取得了满意结果。2.2中的试验也可证实此方法适用于蜂产品检测。2.2复合体素水解反应、金霉素、四环素的最终浓度对样品的确定用经过微生物杯碟法检测的已知阴性样品10份(蜂蜜5份,蜂王浆5份),按本方法进行10次试验,观察结果表明,10次均成阴性,筛选率为100%。在已知阴性样品中(蜂蜜5份,蜂王浆5份)添加四环素的最终浓度为0.025mg/kg时,按本方法进行10次试验,观察结果表明,10次均成阳性,阳性筛选率为100%。在已知阴性样品中(蜂蜜5份,蜂王浆5份)添加土霉素的最终浓度为0.03mg/kg时,按本方法进行10次试验,观察结果表明,10次均成阳性,阳性筛选率为100%。在已知阴性样品中(蜂蜜5份,蜂王浆5份)添加金霉素的最终浓度为0.03mg/kg时,按本方法进行10次试验,观察结果表明,10次均成阳性,阳性筛选率为100%。在已知阴性样品中(蜂蜜5份,蜂王浆5份)添加四环素的最终浓度为0.05mg/kg时,按本方法进行10次试验,观察结果表明,10次均成阳性,阳性筛选率为100%。在已知阴性样品中(蜂蜜5份,蜂王浆5份)添加土霉素的最终浓度为0.05mg/kg时,按本方法进行10次试验,观察结果表明,10次均成阳性,阳性筛选率为100%。在已知阴性样品中(蜂蜜5份,蜂王浆5份)添加金霉素的