辣椒诱导抗病病研究进展

辣椒诱导抗病病研究进展

青椒起源于美国和南美洲。由于其丰富的营养成分以及新鲜的味道，它在世界各地种植很受欢迎。其产量是茄子中的一流蔬菜。辣椒在我国各地均有栽培,并已成为农民致富的重要经济作物之一。我国辣椒种植面积广,但由于各地环境条件相差比较大,辣椒病害种类多且为害严重,已成为我国辣椒生产的主要障碍。开发利用植物抗病性潜能是病虫害综合防治的一条潜在途径。近年来,国内外在辣椒诱导抗病性研究方面取得了不少重要成果,其中有些研究成果已在生产上推广应用,为辣椒病害的综合防治开辟了一种新的有效的手段。主要诱抗剂的制备在农作物诱导抗病性研究中,以辣椒为对象的目前还比较少,并且已见报道的只有病毒病、疫病和炭疽病等,所用的诱抗剂也仅仅局限于少数几种,下面就目前对辣椒诱导抗病性的研究作简要回顾。1病毒卫星rna诱导的未来在接种中的抗性病毒病是危害辣椒生产的严重病害。随着辣椒栽培面积的扩大,病毒病的危害日趋严重,流行年份可使椒果减产达10%以上。辣椒病毒病虽一直是育种学家致力解决的重要病害之一,但由于其寄主范围极广,又容易发生突变,故至今仍没有选育出抗病毒病的辣椒品种,也没有形成任何能有效控制该病的方法。引起辣椒病毒病的病原有黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯X病毒(PVX),田间多为混合侵染,即几种病原同时侵染同一株寄主植物,这种情形比单一病原侵染的防治难度更大。目前利用外源诱抗剂诱导辣椒抗病毒病已经取得了显著的进步,虽然尚未真正应用到生产上,但已显示出其广阔的发展前景。用TMV的弱突变株系预先在辣椒上接种,诱导辣椒获得对TMV强毒株系侵染的抗性。如Murata等从TMV弱毒株系C-1421感染的甜椒叶片中提取2%粗提液,喷洒于1～2叶的甜椒幼苗上,结果表明幼苗最初显示轻微的花叶症状,几天后,症状逐渐消失;再接种TMV强毒株系,该预接种的甜椒植株比未经预接种的表现高度抗病性,而且果实上不表现病症,产量未受影响。然而,在已进行的田间试验中,这类预接种还没有获得成功的报道,因为以TMV弱突变株系预接种的辣椒植株接种强毒株系,其产量虽然比只接种强毒株系的高,但比未经接种的植株却明显降低。Tanzi以辣椒花叶病毒进行试验也获得了相似的结果:即在温室内用辣椒花叶病毒的弱毒系M-1诱导辣椒抵御强毒株系pepMV9的侵染时,经此处理的辣椒植株只表现轻微的花叶症状,而未经预接种但感染pepMV9的辣椒,却显示严重的花叶症状;从产量上分析,两者分别是未经接种的对照植株的76.3%和48.8%。病毒卫星RNA是依赖于病毒才能复制的一类低分子量RNA,它可以减轻或增强由病毒引起的病害的发生。1981年田波等首先证明了CMV卫星RNA能够有效地防治由CMV强毒株系引起的严重病害。之后,Montasser-MS用一种减轻病害的病毒卫星RNA与CMV弱毒株系CMV-S结合作为诱抗剂,预接种于辣椒和甜瓜,然后再用CMV的强毒株系CMV-D和CMV-16挑战接种,通过四a的温室和田间试验证明病毒卫星RNA能有效地诱导植株对CMV的强毒株系产生抗病性。但在田间试验中,也出现了上面提及的现象:即经预接种和挑战接种的辣椒植株虽比只接种强毒株系的辣椒植株产量高,但比对照植株低,为对照的80%。出现这种现象的原因可能是因为对照植株的生长季节发病较晚,产量未受病害的影响或影响较小;而经预接种的植株虽然比只接种强毒株系的植株产量高,但由于其症状表现较早,依然影响了植株的产量,导致最终产量低于对照。病毒弱毒株系和病毒卫星RNA诱导作物产生的这类抗性,其作用机制可能是由于它们与病毒强毒株系之间存在相同的作用位点或相同的酶系,病毒弱毒株系和病毒卫星RNA既预先占据了这些作用位点或酶系,强毒株系的大量表达受到抑制,故起到了抗病作用。也有人认为卫星RNA的作用机制是卫星RNA与病毒基因组RNA争夺病毒复制酶。因为卫星RNA分子小,分子周期短,随着复制循环的增加,卫星RNA的复制量远远大于基因组RNA的复制量,大量的卫星RNA占据复制酶,必然使病毒基因组RNA的复制减少,故预接种植株表现出抗病毒的特性。2自然生物及其诱抗剂对辣椒病的影响辣椒疫病是辣椒生产上另一种毁灭性病害,其发病迅猛,在流行年份可造成很大损失。多年来,病理学家和育种学家一直致力于研究这种重要病害,并已育出多种抗疫病的辣椒品种。此外,研究表明,一些生物或非生物诱抗剂也表现对辣椒疫病的诱抗效果,可以作为一种辅助手段帮助消灭疫病的发生。目前已见报道的这种诱抗剂有β-氨基丁酸(BABA)、木霉菌等。2.1baba诱导辣椒植株的抗疫机理β-氨基丁酸(BABA)是一种植物体内次生代谢的非蛋白氨基酸,用它做为诱抗剂处理辣椒,可以诱导辣椒对随后接种的疫霉菌产生抗性,降低甚至抑制疫病的发生。例如:Sunwoo-JiYoon等以1000和2000μg/mL的氨基丁酸的三种同分异构体α、β、γ-氨基丁酸(AABA、BABA、GABA)的水溶液喷洒辣椒植株,以清水做对照,4d后挑战接种疫霉菌。试验结果显示GABA与对照病情指数相似,表明其没有诱抗活性;二种浓度的AABA诱抗效果分别是30%和40%,而BABA在二种浓度的诱抗效果均可达到100%,只是在2000μg/mL时,处于分枝期的辣椒叶片变黄且出现棕色斑点。而在实验室内的抑菌活性实验中,1000μg/mL的AABA、BABA、GABA均不能抑制疫霉菌菌丝的生长和游动孢子的萌发。此外,经BABA处理的植株上接种疫霉菌的坏死病斑,其扩展速度明显慢于AABA、GABA处理的植株。用1000μg/mL的BABA处理辣椒,1、4、7d后挑战接种疫霉病,其诱抗效果分别达到47%、85%、100%。这表明BABA的保护效果随着时间的推移而逐渐增强,这种抗性是由多基因控制的数量抗性,且诱导处理与挑战接种的时间间隔至少在4d以上。但也有报道认为,间隔时间有3d即可,且抗性可持续20d以上。Lee-YeonKyeong等在电子显微镜下观察了经BABA诱导处理后挑战接种疫霉菌的辣椒的组织与超微结构,发现BABA处理的植株,其随后侵染的病原菌菌丝生长和孢子形成明显受到抑制。其中一个很显著的超微结构特征是BABA处理的植株形成了细胞壁乳突,而病原菌的吸器被包裹在这些又厚又密的乳突中难以发展,致使侵入植物组织中的病原菌难以进一步入侵;另一个特征是被侵入菌丝的细胞质中,其线粒体结构退化,变得没有可区分的双层膜层和完整的嵴。这些结果表明BABA诱导了辣椒枝干组织超微结构的变化,达到了抑制病菌侵染的目的。关于BABA的诱抗机理,这方面的研究是BABA可诱导辣椒枝干合成β-1.3-葡聚糖酶和几丁质酶,特别是BABA处理后挑战接种疫霉菌,枝干上的这两种酶积累更加显著,用变性蛋白免疫印迹分析发现同时有β-1.3-葡聚糖酶和几丁质酶的几种同工酶同时出现BABA处理后,β-1.3-葡聚糖酶的同工酶Ga1被诱导和积累,几丁质酶的两种同工酶Ga1和Ga3都不积累,但挑战接种后,几种酶的积累非常显著。这些结果似乎表明β-1.3-葡聚糖酶和几丁质酶这两类物质可能参与了植株的抗病反应。然而,Mauch等的抑菌活性试验表明β-1.3-葡聚糖酶和几丁质酶具有抗镰孢菌活性而对卵菌无效。众所周知,疫霉菌属于卵菌,其细胞壁成分由纤维素而非几丁质组成;Cohen等在BABA诱导番茄的实验中发现β-1.3-葡聚糖酶只在预处理叶片积累,在未经预处理的上部叶片并不增加,因而Cohen等认为β-1.3-葡聚糖酶和几丁质酶可能与对疫霉的诱导抗性无关。综合上述观点,β-1.3-葡聚糖酶和几丁质酶在诱导辣椒抗疫病中的作用还有待进一步研究证实,但可以肯定的是这二种酶并不是直接抑制疫霉菌的入侵,而可能是通过间接方式参与诱导抗疫病的。辣椒植株单独接种疫霉菌,水杨酸含量水平是对照的2～4倍,而经BABA预处理后再接种疫霉菌,3d后水杨酸可达到对照的12倍,这些结果表明水杨酸可能是一种重要的内源合成化合物,能活化辣椒植株体内抗疫霉菌的特殊组分和诱导PR蛋白的表达。而在最近对烟草和拟南芥的研究中,已经证实了在导致系统获得抗性的信号转导途径中水杨酸的积累,即表明水杨酸是植株获得系统抗性过程中的一种重要的信号分子。其在拟南芥中所诱导的信号途径已经得到了广泛的认同。还有试验表明,细菌Pseudominasputida中的nahG基因编码水杨酸羟化酶(E.C.1.14.13.1)可催化SA转化为儿茶酚。Gaffney等构建了结构性表达nahG基因的烟草植株,这种转基因植株积累了大量酶蛋白,即使受病原物诱导接种,其SA积累量也很低,且植株上部未处理叶片不能积累PR-1,不产生SAR,这表明SA是植物产生系统获得抗性(SAR)所必需的。在拟南芥中,SA诱导表达的PR基因主要是PR-1、PR-2和PR-5;在烟草中,SA诱导表达的主要是酸性PR基因。BABA诱导处理后,植株体内过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸裂解酶(PAL)的含量明显升高,说明它们也可能参与了抗性机制。BABA可以诱导番茄和瓜类根部木质化和表达过氧化物酶,而该酶的一些同工酶可能参与H2O2的产生。现已证实H2O2及其产生的活性氧在植物抗病作用中,可能存在如下作用:(1)直接攻击入侵的病原物,造成病原物细胞质膜过氧化,膜通透性增大,膜电位下降,从而降低病原物活性,抑制其繁殖,甚至杀死病原物。(2)在非亲和互作中,快速交联植物细胞壁中的一些结构蛋白,使细胞壁结构加固,从而增强对病原物释放的水解酶的抵抗能力。(3)引发植保素的合成。(4)调节防卫基因的表达。(5)诱导寄主发生过敏性反应与细胞死亡。番茄14C-β-氨基丁酸同位素示踪试验也表明,大部分14C-BABA完整地进入番茄植物体,而只有一小部分可能直接或者通过交联与细胞壁联结,这些结果支持了BABA的联结目标可能是细胞壁蛋白这一假说。最近一些研究显示,番茄和烟草细胞壁共价联结的14C-BABA能溶于K-蛋白酶、纤维素酶和果胶酶。这些细胞壁联结蛋白或细胞壁交联蛋白使寄主细胞壁能抵抗真菌酶类的降解。此外,BABA不能诱导辣椒素的积累,但可提高辣椒对疫霉菌侵染发生反应时合成辣椒素的能力。2.2木霉菌对实生品中样品中微生物指标的影响Ahmed-Sid-Ahmed等以木霉菌的孢子悬浮液处理辣椒种子或灌根,诱导植株获得了对疫病的系统抗性。他们的方法是用木霉菌的孢子悬浮液处理辣椒种子,然后在辣椒幼苗长至5片真叶时挑战接种疫霉菌,并于接种后的3、6、9d分别调查接种和未接种植株上的坏死斑的长度分别是2.4、14.8、27.7和5.3、22.9、48.6mm;灌根处理的植株也获得相似的结果。这些试验结果清楚地显示出辣椒枝干经木霉菌预处理后,其坏死斑的扩展明显受到抑制,即疫霉菌的侵染速度显著降低。而在坏死斑及其周围区域,只能分离到疫霉菌,却分离不出木霉菌;只有从处理的根部或根际区,才可以分离到木霉菌。这些结果证明木霉菌处理辣椒,对疫病产生的抗性是通过诱导获得的,而且这种抗性可能是多个微效基因控制的数量抗性。木霉菌处理与挑战接种植株后,植株体内辣椒含量变化差异较大:接种后3d,接种和未接种植株体内的辣椒素含量虽相差不大,但6d后,前者是后者的7.4倍,9d后,后者含量明显增加,而前者则含量下降到与未接种处理植株的含量水平相似。木霉菌预处理可以诱导辣椒对相距甚远的疫霉菌的侵染产生抗性,这种抗性的部分作用机制可能是有抑制性的代谢物质产生,以及木霉菌在寄主中与疫霉菌争夺空间和养分,并在竞争中占据了主动。木霉菌产生的木聚糖酶可诱导烟草和番茄表达一种T-Sumo蛋白,而这种蛋白被认为参与了防御反应机制。总之,木霉菌可能通过多种途径参与包括诱导抗性在内的多种抗性反应。植株在坏死区域产生辣椒素,可以延缓疫霉菌的生长和减少侵染,并通过与防御反应中的别的因子联合,在诱导抗性中起作用。3灌根保护两组植株对炭疽病的抗性JeumKynHong等从AABA、BABA和GABA的抑菌活性实验发现,1000μg/mL的AABA在培养基中对炭疽菌丝的抑制率仅有29%,而同浓度的BABA和GABA则没有抑制作用;在浓度100μg/mL时,这三种同分异构体均不影响炭疽菌丝正常生长。用BABA喷洒六叶期的辣椒叶部,4d后接种1.5×105个分子孢子/mL的炭疽病菌,其病斑随BABA浓度增加而减少,浓度达1000μg/mL就可完全保护辣椒免受炭疽病侵染;用AABA处理的椒苗,其炭疽病斑也随浓度增加而减少,并在1000μg/mL时达到75%的最大保护效果;而GABA处理的效果则很不明显。改用灌根处理椒苗,也可观察到BABA比AABA和GABA能更有效诱导植株对炭疽病的抗性,BABA在浓度100μg/mL和1000μg/mL时,分别可提供73%和85%的保护;而1000μg/mL的AABA和GABA只能分别达到60%和35%的保护。用1000μg/mL的BABA对八叶期的辣椒进行灌根,并分别于5、10和15d后接种炭疽病菌,可分别达到93%、96%和85%的保护;与此相反,如处理后立即接种,则10、100和1000μg/mL的BABA均只能达到50%左右的保护。接种后8d调查病斑大小发现,未处理植株的病斑直径为2.5mm,而BABA处理者的病斑直径介于0.9～2.0mm之间,且随着BABA的浓度增加而逐渐减小。这些结果表明BABA灌根处理后5d再挑战接种,可有效地降低辣椒叶片上病斑的大小。对BABA处理下部两片叶片所诱导的系统抗性研究发现,虽然下部两片叶片单位面积内的病斑数没有明显不同,但BABA处理后7d接种炭疽病菌的植株,其上部叶片的病斑数明显比处理后1d接种的要少得多,且病斑直径减小。这些结果也反映出植株经BABA诱导后需要一段时间的积累才能产生足够的抗性物质。问题和视角的未来(1)缺乏有效的诱导抗性从对病毒病的研究我们了解到病毒弱毒株系和卫星RNA确实可以诱导辣椒对强毒株系的侵染产生抗性,但是由于这些弱毒株系和卫星RNA都与其强毒株系有很高的同源序列—有的仅只有几个碱基的差异—而病毒又极易发生突变,它们极有可能由原来的减弱病情突变为增强病情,导致更严重的病害发生。此外,确定合适的预接种时间也是至关重要的,因为接种过早,可能适得其反,引起不必要的减产;过晚则不起作用。但要做到适时接种目前还做不到。因而这一方法在短