纤维基可降解输尿管支架管生物相容性的初步研究

纤维基可降解输尿管支架管生物相容性的初步研究

临床上常用的传统不可分解管支架应通过膀胱镜取出，以造成患者的二次损伤。因此，可分解积聚管的新形式已成为科学家的新研究热点。制作可降解输尿管支架的材料必须经过生物相容性的评估。生物相容性是指生物体组织对非活性材料产生反应的一种性能,一般是指材料与宿主之间的相容性。生物材料植入机体后,生物材料必须具有良好的生物相容性才能保证临床应用的安全性。本研究通过对我们制作的可降解输尿管支架管的细胞毒性试验和肌肉埋置试验来研究其生物相容性。1材料和方法1.1实验动物的制备新型可降解支架管及阳性对照组天然乳胶材料由东华大学纺织学院提供,尿源性细胞及培养液由上海交通大学附属上海市儿童医院中心实验室提供,吸光度测定在上海交通大学附属上海市儿童医院检验科完成,SD雄性大鼠共60只,体重150～250g,购于上海斯莱克实验动物中心,委托上海交通大学医学院附属新华医院动物实验室饲养。1.2材料浸提液制备及测定指标将150℃和210℃两种条件下制备输尿管支架管,剪成5mm长的试样,环氧乙烷灭菌,用PBS冲洗3次后置入无菌培养皿中保存,乳胶材料裁剪成同样大小置入无菌培养皿内备用。用预热的尿源性细胞培养液预湿后置入60mm细胞培养皿中,按照6cm2/ml的标准加入尿源性细胞培养液,37℃、5%CO2培养箱内静置24小时后,吸出浸提液于4℃保存备用。将第4代尿源性细胞用0.05%胰蛋白酶消化后,制成4×104/ml单细胞悬液。设置阴性对照组(细胞和正常培养基)、阳性对照组(天然乳胶材料浸提液)和两组实验组(两种不同制作条件下的支架管浸提液),每组各6孔。以每孔细胞4000个细胞接种于96孔板中,按各组添加不同浸提液100μl,每隔24小时换液一次。24、72和120小时后,各取出96孔板,每孔加入CCK-8溶液10μl,继续培养4小时后终止培养。选择450nm和630nm双波长,设置A2为空白孔,空白孔加入细胞培养液及CCK-810μl,在酶联测试仪上测定各孔吸光度值。设定空白孔的吸光度值为零,读出各孔吸光度值。计算细胞相对增殖率(relativegrowthrate,RGR)=实验组吸光度值/空白组吸光度值×100%,并对材料毒性评分,计算平均值对材料毒性总体评级。毒性评定:按表1将RGR值转换成5级评分,评价测定材料的毒性反应分级。结果评价:0或1级反应为合格;2级反应须结合细胞形态分析,综合评价;3,4级为不合格。1.3大鼠前肌肉注射给予大鼠肌肉埋植样品试件及病理检查将SD大鼠随机分成3组,每组20只,10只放置150℃支架管,其余10只放置210℃支架管,分别在第1、4、12周处死动物,其中左侧臀部肌肉埋植纤维基输尿管支架管材,右侧臀部肌肉埋植同样大小的天然乳胶材料为阳性对照组。分别在1周、4周、12周,以过量麻醉处死大鼠,取出大鼠臀部试件及周围的肌肉组织;HE染色后行病理检查。主要观测纤维化和炎症反应的程度及材料/组织界面炎症细胞的类型,即中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞及其他多核细胞的数量分布及囊壁形成情况。2结果2.1细胞毒性试验2.1.1细胞形态观察两个实验组(150℃,220℃)在24、72、120小时三个时间点尿源性细胞均生长良好,细胞形态多数为梭形,贴壁生长,与阴性对照组结果相似,且实验组与空白组随时间的推移细胞数量明显增多,阳性对照组(天然乳胶材料)细胞在观察第1天绝大部分细胞死亡,在培养液中悬浮,有极少一部分细胞贴壁,皱缩,生长状态差,随着时间的延长细胞数量仍极少,且状态差(见图1)。2.1.2各时间点的统计分析吸光度测定结果显示(吸光度为加入CCK-8试剂4小时后测定),两实验组(包括150℃组、220℃组)与阴性对照组比较每一时间点均P>0.05,无显著性差异;与阳性对照组比较每一时间点均P<0.05,具有显著性差异,吸光度具体数值见下表2(统计方法:单因素方差分析,α=0.05;所用软件SPSS13.0)。细胞相对增殖度(RGR%)计算结果显示,上述三种测试材料细胞培养的相对增殖度在不同时间点均大于90%,材料毒性分级为0～1级,即材料合格,细胞生物相容性良好(见表3)。2.2材料的降解和保持组织结构术后6组动物手术动物完全存活,未见明显局部反应,手术切口愈合良好。两组可降解输尿管支架管材料在1周内形态没有明显变化,材料和周围组织界限清晰,周围局部组织有炎性水肿,局部未见中性粒细胞浸润,但是有少量淋巴细胞浸润和巨细胞反应;4周后材料逐渐降解,材料的组织结构逐步消失,失去管状支架结构。和周围组织之间的界限逐渐消失,可降解材料周围均有巨噬细胞围绕,周围可见少量成纤维细胞浸润;12周后材料基本完全降解吸收,局部有仅有极少量单核淋巴细胞浸润,周围肌肉组织已恢复正常。阳性对照乳胶材料组在置入后的12周内保持完好形态。1周乳胶材料周围有明显中性粒细胞增生,并且有大量淋巴细胞和单核细胞增生;4周时纤维结缔组织增生明显,局部炎症反应较可降解组重,呈现慢性肉芽肿改变,局部可见纤维膜形成,12周时样品周围可见纤维母细胞、纤维细胞与胶原纤维,并已形成纤维囊腔结构。见图2。3材料细胞的容性研究我们通过生物相容性的相关鉴定来证明我们的材料具有良好的生物相容性及生物安全性,进一步明确我们的材料可否用于输尿管支架管的制作,是否有潜在的临床应用价值。由于细胞培养方法评价生物学相容性具有简便、迅速、经济、可重复等优点,我们选用了体外浸提液法细胞毒性试验检测了我们所用材料的生物相容性;同时因为动物体内植入实验仍是评价生物材料安全性和有效性的最主要手段之一,我们同时选择了大鼠的肌肉埋植实验。通过体外细胞毒性实验和大鼠肌肉下埋植实验我们从整体和细胞两个层面对纤维基输尿管支架材料进行了较全面的检测。1982年美国质量标准协会将L-929小鼠成纤维细胞和HaLe细胞推荐为细胞毒性试验中的标准细胞,HeLa细胞来源于人的肿瘤组织,但利用这两种细胞代替人体正常组织细胞评价材料的生物相容性是否敏感和可靠仍有争议。Cheung认为不同组织来源的细胞对材料的敏感性是有差异的,从90年代起,越来越多的学者根据材料植入体内的不同部位及使用目的选择人体不同部位和组织来源的细胞作为实验细胞,使体外细胞培养对机体内环境的模拟更趋真实。输尿管支架管置于泌尿系统管道中,直接与尿路上皮接触,用正常人的尿路上皮细胞评价材料的细胞毒性可能更为合适。ParienteJL等采用正常人的尿路上皮细胞测试了几种天然材料和合成材料的生物相容性,取得了更加客观准确的评估结果。但正常人的尿路上皮细胞很难获得,目前主要通过活检取得患者的膀胱组织,体外培养扩增,有创的操作可能引起泌尿系感染等并发症,且可能引起伦理问题;采用根治性膀胱切除术后的膀胱上皮培养,可能存在肿瘤细胞污染,进而影响实验结果的准确性。采用猪或兔等动物的膀胱上皮细胞,首先物种的差异可能影响实验结果,其次动物的细胞可能由于支原体、病毒的污染影响实验的准确性。美国的Zhang等成功从人的尿液中培养出了尿源性细胞,尿源性细胞具有无创性,且尿液为一种排泄废物容易得到。输尿管支架存在于尿液的环境中,因此我们选择了尿源性细胞测定了材料的细胞毒性。生物材料对细胞的毒性与被测细胞的量尤其是表面积相关,我们选择了6cm2/ml的浸提比例。我们的研究结果显示:两组实验组材料在各时间点均细胞生长良好,与空白对照组结果相似,细胞相对增殖度分别为90%～100%之间,毒性分级为1级,即本测试材料细胞毒性评价合格;而阳性对照组(天然乳胶材料),我们用酶标仪测定的吸光度数值都在0.1之下,证明了活细胞的数量是极少的,我们所用的乳胶材料的细胞毒性是较高的。本实验选用大鼠臀部肌肉埋置试验对支架管的生物相容性进行了初步评价。肌肉埋植实验中通常在术后1周就可以观察到材料周围细胞反应性增生;4周时可降解材料分解成细小的颗粒,较小的颗粒可被巨噬细胞所吞噬进入细胞体内,所以材料植入有大量的巨噬细胞和单核细胞趋化聚集在可降解材料周围。材料植入12周后由于可