牛胰RNA水解酶蛋白表达和纯化

牛胰RNA水解酶蛋白表达和纯化

学院：生命科学学院专业：生物科学班级：2002级01班学号：02072030学生姓名：王佳指导教师：黄国俊老师

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背景介绍

选题依据及意义

研究方案及技术路线

课题特色及创新点

实验图谱及结果讨论

总结与展望

研究内容345267目录7背景介绍

从20世纪60年代以来,核糖核酸酶作为一种模型蛋白被普遍用于分子生物学研究。RNase的主要生理功能是控制细胞内RNA的种类与数量分布,除参与核糖核酸转录后的剪切、修饰和降解等过程外,还与宿主的防御机制、控制肿瘤血管生成、杀灭肿瘤细胞及抑制病毒复制等有关。由于RNase家族表现出独特的生物学功能,有可能成为抑制病毒或杀灭癌症细胞的药用蛋白。选题依据及意义曾经引起全世界人民恐慌的疯牛病(BSE)学名为牛海绵状脑病，是一种人畜共患疾病，所以我们无法采用生化提取法安全的从牛胰脏中直接提取无感染的核糖核酸酶制品。RNase基因经过基因工程改造可以在一些重大疾病(如癌症、艾滋病等)的治疗中发挥重要作用。为了开发新的治疗试剂,我们通过基因表达和融合蛋白纯化技术，分析其生理生化功能并得到符合我们要求的酶制剂。研究内容研究分析牛胰脏中RNA水解酶基因如何在原核生物中高效表达。研究分析不同诱导条件下的GST融合蛋白分离纯化目的蛋白的效率。

课题特色及创新点由于无法利用生化提取法直接从牛胰脏中直接得到安全无污染的牛胰核糖核酸酶，所以我们采用基因表达和融合蛋白纯化技术使得目的基因在原核生物中表达。在后续实验中我们将逐步探索RNase

在真核系统中的表达及纯化。本课题采用的是GST融合蛋白纯化技术，综合应用E.coli

DH5a，BL21菌株和pBluescriptSK(-)，pGEX-CS载体，可使得融合蛋白能在此系统中大量高效的表达并纯化，以得到更加符合人们所需要的酶制剂。研究方案及技术路线在NCBI的GenBank中查到RNA水解酶基因序列。利用DNAMAN对RNA水解酶基因片段做酶切图谱分析。通过对RNA水解酶基因序列和酶切图谱分析结果，按照引物设计原则，设计引物。通过PCR反应克隆RNA水解酶基因。对PCR产物进行1.1%琼脂糖凝胶电泳并分析电泳结果。对PCR扩增产物与质粒载体pBluescriptSK(-)进行SmaI和XbaI

双酶切，将目的基因连接到载体上。制备DH5a感受态细胞并用重组质粒转化E.coli。筛选pBluescriptSK(-)重组体，抽提质粒并通过电泳进行验证。对目的基因和质粒载体pGEX-CS进行NcoI

和KpnI

双酶切，将目的基因连接到载体上。制备BL-21感受态细胞并用重组质粒转化E.coli。筛选pGEX-CS重组体并转入表达宿主细胞BL-21中表达融合蛋白。在不同温度和IPTG浓度下诱导GST融合蛋白的表达。用超声波裂解E.coli细胞并跑SDS检测。利用Phamarchia试剂盒的GlutathioneSepharose4B进行GST融合蛋白的纯化。聚丙烯酰胺电泳检测所表达的融合蛋白。实验图谱及结果讨论相关蛋白序列比对图

相关蛋白序列比对图

牛胰RNase基因序列图谱及克隆质粒pBluscriptIISK(-)的酶切图谱

上游引物：GCGCTCTAGA

CCATGG…(36bp,Tm=70.1)XbaINcoI