第十四章 酶类药物

第十四章酶类药物酶药用酶是用于预防、治疗、诊断疾病的一类酶制剂。生物体内的各种生化反应几乎都是在酶的催化作用下进行的，当酶的生物合成受到影响或酶的活力受到抑制，生物体的代谢受阻就会出现各种疾病。此时，若给机体补充所需要的酶，使代谢障碍得以解除，从而达到治疗和预防疾病的目的。药用酶制剂，早期主要用于治疗消化道疾病、烧伤及感染引起的炎症。现在，国内外已广泛用于多种疾病的治疗，其制剂已超过700余种。促进消化酶类消炎酶类与治疗心脑血管疾病有关的酶类抗肿瘤的酶类与生物氧化还原电子传递有关的酶其他药用酶药用酶的来源和生产直接从生物体中分离获得早期，例如：猪颌下腺提取激肽释放酶、菠萝中提取菠萝蛋白酶利用微生物发酵从动物或植物中提取酶受到原料的限制，随着酶应用日益广泛和需求量的增加，工业生产的重点已逐渐转向微生物。用微生物发酵法生产药用酶，不受季节、气候和地域的限制，生产周期短，产量高，成本低，能大规模生产。化学合成生化制备法选择符合要求的动植物材料生物材料的预处理提取纯化1.生物材料的选择（1）不同酶的用料选择（2）注意不同生长发育情况及营养状况,用微生物制酶，故需测其活力来决定取酶阶段。用动物器官提取酶，则与动物年龄及饲养条件有关。（3）综合成本：从原料来源是否丰富考虑，从简化提纯步骤着手（5）如用动物组织作原料，则此动物宰杀后应立即取材。

2.生物材料的预处理

材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。

酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：—是释放到细胞外的酶，叫胞外酶；二是游离在细胞内的酶．叫溶酶；三是牢固与膜或细胞颗粒结合在—起的，叫结酶，后二者合称胞内酶。由于酶蛋白分布不同，提取方法有所差异。

微生物胞外酶，用盐析，或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀酶，制成酶泥。胞内酶需收集菌体，经破细胞后提取。其中结酶还有个打断酶蛋白和细胞颗粒结合的问题。动植物细胞，也有打破细胞的问题，对动物材料，应剔除结缔组织、脂肪组织等；对植物材料如种子应去壳．以免单宁等物质着色污染。a、机械处理用绞肉机绞，成为组织糜。许多酶可以从较粗的组织糜中提取出来，但不能太粗。选择孔径，先粗后细。用绞肉机一般细胞并不破碎。有的酶必须细胞破碎后才能有效地提取，在实验室常用的是玻璃匀浆器和组织捣碎器。工业上用高压匀浆机。b、反复冻融冷到-10℃左右，再缓慢溶解至室温，如此反复多次。由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使某些酶释放出来。c、丙酮粉组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减少酶的变性，同时因细胞结构成份的破碎使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中。常用的方法是：将组织糜或匀浆悬浮于0.0lmol／L，pH6.5的磷酸缓冲液中，在0℃下一边搅拌，一边徐徐倒入10倍体积的-15℃无水丙酮内，10分钟后，离心过滤取其沉淀物，反复用冷丙酮洗几次，真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低温下可保存数年。d、微生物的预处理要是酶是胞外酶，则可除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶。但对胞内酶则需将菌体细胞破壁，制成无细胞的悬液后再行提取。通常用离心或压滤获得菌体。絮凝剂：(1)絮凝剂中和了悬浮粒子表面上的电荷(菌体细胞表面上亦存在着羧基和氨基，故带有电荷)，最终导致了这些粒子的絮凝。(2)絮凝剂的包埋或吸附作用，把菌体及其它不溶性粒子机械地吸附并包埋在其中。菌体用生理盐水洗涤除去培养基后，应深冻保存。3、酶的提取a、水溶液法常用稀盐溶液或缓冲液提取。组织糜、匀浆、细胞颗粒、丙酮粉温度温度通常控制在0一4℃左右.如果酶比较稳定时，可以例外。如胃蛋白酶可在37℃F保温抽提。pH，首先考虑酶的稳定性。选用pH不应超过酶的PH稳定范围。其次，从抽提效果出发，最好远离待抽提酶的等电点。也就是说，酸性蛋白宜用碱性溶液抽提；碱性蛋白宜用酸性溶液抽提。第三，在某些情况下，抽提还兼有切断酶与细胞内其它成分间可能有的联系，从这点出发，选用pH4—6为佳。盐，大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度。所以，抽提液一般采用等渗溶液。最普通的为0.020—0.050mol/L的磷酸缓冲液,0.15mol/LNaCl等。据报道，少数情况下用水抽提亦佳,这可能与低渗破坏细胞结构有关.抽提液用量抽提液用量常采用原料量的1—5倍。有时，为了抽提效果好些需要反复抽提时．抽提溶液比例可能大些.b、有机溶剂法某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂质牢固结合，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。正丁醇兼有高度的亲脂性和亲水性(特别是磷酸盐)，能破坏蛋白间的结合使酶进入溶液，如琥珀酸脱氢酶。c、表面活性剂法表面活性剂能与蛋白质结含而分散在溶液中，故可用于提取结合酶。如胆脂酸盐、Triton、Tween、Teepol、十二烷基磺酸钠等抽提后的细胞残渣或固体成分可用离心或过滤除上，在离心时，加入氢氧化铝凝胶或磷酸钙等物质，有助于除去悬浮的胶体物质。有些工业上用酶还需要脱色。但需考虑：在酶的提取分离过程中的什么阶段进行脱色处理，使脱色工作量最少，又不由于脱色操作而引入杂质。工业上常用的脱色剂是活性炭。活性炭的用量一般为0．1％一1．5％，根据色素的多少而增减。一般由于活性炭颗粒较小，采用静态吸附法进行脱色。4、酶的纯化评价纯化工艺主要看二个指标，一是酶比活，二是总活力回收。

比活力(SpecificActivity)是酶纯度的量度，即指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用IU/mg蛋白质来表示。一般来说，酶的比活力越高，酶越纯.

酶活力(EnzymeActivity)也称酶活性，履指酶催化一定化学反应的能力.在实践工作中选择方法时:首先应对被纯化的酶的理化性质(如溶解度、分子量大小、稳定性和解离时电学性质等)有—个比较全面的了解，这样，就可以知道在分离纯化时可以选用那些方法和条件，避免哪些处理，从而得到好的纯化效果;其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶活性为标准。一个好的方法和条件是比活力提高得多，总活力回收多酶在纯化过程中的一些技术难点：（一）杂质的除去酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、多糖、脂类和核酸等a、热变性

利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使某些非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最为简便，不需消耗任何试剂，但分离效率较低，通常用于生物大分子的初期分离纯化。

如制备脂肪酶时，在pH3、4时以400C温度加热150min，淀粉酶活力可丧失90%而被除去，而脂肪酶活力仍保持80％以上。b、选择性酸碱变性

利用蛋白质和酶等对于溶液中酸碱不同pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤。

c、蛋白质表面变性法：

蛋白质表面变性后其性质有所不同，借以去除杂蛋白。如制备过氧化氢酶时，加入氯仿和乙醇进行振荡可以将杂蛋白变性而去除。d、选择性变性法：