灯盏甘薯注射液体外抗菌活性及其无菌检查方法的初步研究

灯盏甘薯注射液体外抗菌活性及其无菌检查方法的初步研究

灯盏细辛注射液是用菊花短杯飞蓬（vat.）盐提取物提取而成的无菌溶液。主要用于止血、中风、瘫痪和其他疾病的治疗。依据现行中国药典标准对其进行无菌检查时,结果显示其对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用,为避免无菌试验可能造成的假阴性结果而影响判断,本文分别用不同的方法对其体外抗菌、抑菌作用进行了考察,应用薄膜过滤法对其进行无菌检查,无菌验证实验确定其无菌检查的有效方法为薄膜过滤法,作者为其它抗菌中药注射液的无菌检查提供参考。1药品、试剂与仪器硫乙醇酸盐液体培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003](中国药品生物制品检定所);0.9%无菌生理盐水(中国大冢制药有限公司);去离子水(解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所制水室);灯盏细辛注射液(批号:20000301、20000303、20000402,云南生物谷弥勒药业有限公司);HTY-Ⅲ型集菌仪(杭州高得医疗器械有限公司);LDZX-40BI型全自动蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂);恒温培养箱(天津兄弟科学工业社);100级净化工作台(北京半导体设备一厂);精密酸度计(上海雷磁仪器厂)等。2方法2.1保鲜剂含菌量的确定取金黄色葡萄球菌的新鲜营养琼脂培养物1白金耳接种于9ml营养肉汤培养基,于(32.5±2.5)℃培养18h,取肉汤培养混合物1ml,以0.9%无菌生理盐水递比稀释到10-6浓度,取10-3及10-6浓度的稀释管进行活菌记数以确定其含菌量分别为105～106cfu/ml及10～102cfu/ml。2.2ph测定和调节按照培养基说明取需要的量用去离子水进行制备,用精密酸度计进行pH测定,必要时进行pH调节,121℃、15min蒸汽灭菌,通过质量考察后在规定的期限内使用。2.3无菌检验法及抗菌实验参照中国药典2000版一部附录进行。2.4无菌试验2.4.12倍稀释法参照文献方法进行,选取硫乙醇酸盐液体需气厌气培养基及营养肉汤培养基两种培养基,处理方法如表1,并进行活菌记数。2.4.2灯盏细实践培养参照文献方法,取装量为15ml的硫乙醇酸盐液体需气厌气培养基8管,以无菌操作法分别加入灯盏细辛注射液0.1、0.2、0.4、1.0、1.5、2.0、2.5、3.5ml,另取金黄色葡萄球菌液1.0ml分别加入以上8只培养基管中,混合均匀,于(32.5±2.5)℃培养24h,同时设空白及阳性对照,观察结果,并进行活菌记数。2.4.3过滤法取灯盏细辛注射液11支,参照中国药典2000版一部附录进行无菌检查。2.4.4细菌回收率测定参照文献方法修改如下:取灯盏细辛注射液5支,以无菌操作方法用0.45μm滤膜过滤,滤膜用0.9%无菌生理盐水(50ml×3次)洗涤该膜,在最后一次洗涤时加入含约100个金黄色葡萄球菌液1.0ml,滤过后取该膜于(32.5±2.5)℃用平皿培养24h并记数;实验时同时取金黄色葡萄球菌液1.0ml用平皿记数,计算细菌回收率。回收率按照下面计算公式进行计算:回收率(%)=滤膜的平均菌落数/平皿记数的平均菌落数×100%3结果3.1细菌生长和接种量无菌检查法抑细菌实验表明,灯盏细辛注射液对金黄色葡萄球菌有较为强大的抑制作用,按照中国药典2000版一部附录规定的接种量阳性对照观察不到有金黄色葡萄球菌生长现象。3.2细菌培养方法结果无菌检查法抑细菌实验提示可能直接接种法并不适用于灯盏细辛注射液法的无菌检查。为此,我们进一步进行了体外抗菌、抑菌实验。二倍稀释法(硫乙醇酸盐液体需气厌气培养基)结果、二倍稀释法(营养肉汤培养基)结果分别见表2,表3;药物直接接种法结果见表4。由表2、表3、表4可见:二倍稀释法(硫乙醇酸盐液体需气厌气培养基)结果显示其最小抑制细菌生长浓度为(MIC)0.0977%(v/v);二倍稀释法(营养肉汤培养基)结果显示其MIC为0.195%(v/v);药物直接接种法结果显示其MIC为0.621%(v/v)(即接种量0.1ml时的药液浓度)。3.3膜过滤法的实验薄膜过滤法验证实验结果见表5。4对细菌的抑制作用及灯盏微细注射液法的消毒处理我们按照中国药典2000版一部附录规定的接种量进行无菌检查法抑细菌实验,结果在阳性对照管中没有观察到金黄色葡萄球菌的生长现象,这提示灯盏细辛注射液对金黄色葡萄球菌可能具有较为强大的抑制作用,同时也提示可能直接接种法并不适用于灯盏细辛注射液法的无菌检查。为了慎重起见,我们应用不同的方法进行了灯盏细辛注射液体外抑菌作用测定,进一步的体外抗菌、抑菌实验显示其体外具有较强的抗菌、抑菌作用,更加证实直接接种法并不适用于灯盏细辛注射液法的无菌检查,试图为其对金黄色葡萄球菌抑制作用及灯盏细辛注射液法的无菌检查提供依据。表3实验管在培养24h后继续培养至7d,结果显示在培养72h时,接种灯盏细辛注射液量为0.1、0.2、0.4ml均出现浑浊,表明细菌已经生长,而在灯盏细辛注射液接种体积≥0.6ml的接种管中,始终未见细菌生长现象。尽管不同的实验方法显示其最大抑制细菌生长浓度略有差异(见表2、表3、表4),但是以上多次实验结果同抑细菌实验一并无疑表明无菌检查的直接接种法不适用于灯盏细辛注射液法的无菌检查。取灯盏细辛注射液(批号:20000301;20000303;20000402生产厂家:云南生物谷弥勒药业有限公司)各11支,应用薄膜过滤法进行检查,结果表明用0.9%无菌生理盐水(100ml×3次)洗涤滤膜后,阳性对照及样品阳性的金黄色葡萄球菌都能够在24h内正常生长,目视未见有明显差别,随后的薄膜过滤法验证试验得到的金黄色葡萄球菌回收率均在80%以上(见表4),确定其无菌检查的有效方法为薄膜过滤法。文献报道灯盏细辛注射液主要化学成分为总黄酮,我们在实验中还发现其体外抑制金黄色葡萄球菌的作用并不因为高温湿热灭菌而改变(见表1处理组的1、2组),说明其抑菌的主要成分可能为对湿热保持相对