《工业微生物实验技术》课件第五章 微生物在各行业生产中的应用

微生物在各行业生产中的应用

实验5-1酸乳的制作实验5-2甜酒酿的酿制实验5-3谷氨酸发酵实验5-4乙醇发酵试验实验5-5阿维菌素发酵实验5-6单细胞蛋白生产实验5-7纤维素分解实验5-8有机磷农药的生物降解实验5-9活性污泥中菌胶团及生物相的观察

实验5-1酸乳的制作一、实验目的学习酸乳的制作方法。二、实验原理酸乳是以牛乳为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后而制成的一种乳制品饮料。当乳酸菌在牛乳中生长繁殖和产酸至一定程度时，牛乳中的蛋白质就凝结成块状。它具有清新爽口的味觉。由于酸乳中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，它对肠道内的致病菌有一定的抑制作用，故对人体的肠胃消化道疾病也有良好的治疗效果。通过本实验学习制作酸乳和成品质量的评定。

实验5-1酸乳的制作三、实验材料

1.酸乳菌种市场销售的各种酸乳。

2.培养基酸乳发酵培养基（市场销售的牛乳）。

3.其他无菌血浆瓶(250mL)，恒温水浴锅，培养箱，冰箱等。四、实验方法

1.配复原牛奶：用市售鲜牛奶加入5～6%蔗糖调匀即可。

2.装瓶：在250mL的血浆瓶中装入牛乳200mL。

3.消毒：将装有牛乳的血浆瓶置于80℃恒温水浴锅中用巴氏消毒法消毒15min，或者置于90℃水浴中消毒5min即可。

实验5-1酸乳的制作

4.冷却：将已消毒过的牛奶冷却至45℃。

5.接种：以5～10%接种量将市售酸乳接种入冷却至45℃的牛奶中，并充分摇匀。

6.培养：把接种后的血浆瓶置于40～42℃温箱中培养3～4h(培养时间视凝乳情况而定)。

7.冷藏：酸乳在形成凝块后应在4～7℃的低温下保持24h以上(称后熟阶段)，以获得酸乳的特有风味和较好的口感。

8.品味：酸乳质量评定以品尝为标准，通常有凝块状态、表层光洁度、酸度及香味等数项指标，品尝时若有异味就可判定酸乳污染了杂菌。

实验5-1酸乳的制作五、实验报告记录各批混菌发酵的酸乳品评结果，包括凝乳情况、口感、香味、异味、pH。注意事项：在酸乳发酵及传代中应避免杂菌污染，特别是芽孢杆菌的污染，否则可导致酸乳产生异味。返回实验5-2甜酒酿的酿制

一、实验目的学习甜酒酿的酿制方法。二、实验原理酿制甜酒酿的原理十分简单，即将煮熟的米饭经接种酒酿种曲后，在适宜的培养条件下让种曲中的根霉孢子萌发成菌丝体；经大量繁殖后通过淀粉酶的作用将淀粉转化为葡萄糖，此为根霉的糖化阶段。然后，再由根霉或种曲中所含的酵母菌或野生酵母菌继续将糖化后的部分葡萄糖转化为乙醇，经后熟使甜酒酿具有独特的甜醇口味。实验5-2甜酒酿的酿制

三、实验材料

1.菌种来源“浓缩甜酒药”(沪产)或苏州等地产“甜酒药”、“幽白药”或小曲。

2.培养基糯米饭，马铃薯葡萄糖培养基。

3.其他研钵，培养皿，试管，移液管，接种环等。四、实验方法

1.选择原料：酿制甜酒酿的原料常用糯米，选择时，力求用品质好、米质新鲜的糯米。

2.淘洗和浸泡：将米淘洗干净后浸泡过夜，使米粒充分吸水，以利蒸煮时米粒分散和熟透均匀。实验5-2甜酒酿的酿制

3.蒸煮米饭：将浸泡吸足水分的糯米捞起，放在蒸锅内搁架的纱布上隔水蒸煮，至米饭完全熟透时为止。

4.米饭降温：将蒸熟的米饭从锅内取出，在室温下摊开冷却至80℃左右待接种。

5.接入种曲：按干糯米重量换算接种量。市售“甜酒药”每包能酿制3kg糯米；而沪产“浓缩甜酒药”每包可接1.5～2kg糯米。为使接种时种曲与米饭拌匀，可先将酒药块在研钵中捣碎，或再拌入一定数量的炒熟面粉后再与大量米饭混匀。实验5-2甜酒酿的酿制

6.装坛发酵：接种拌匀后的米饭可装坛子发酵（通常应在坛子的中轴留一散热孔道）。所用的容器都应预先洗净，并用开水浇淋浸泡过，以杀死大部分杂菌。

7.保温发酵：温度可控制在30℃左右，发酵初期可见米饭表面产生大量纵横交错的菌丝体，同时糯米饭的粘度逐渐下降，糖化液渐渐溢出和增多。若在发酵中米饭出现干燥时，可在培养18～24h补加一些凉开水。

8.后熟发酵：酿制48h后的甜酒酿已初步成熟，但往往略带酸味。如在8～10℃条件下将它放置2～3天或更长一段时间进行后发酵，则可去尽酸味。

9.质量评估：酿成的甜酒酿应是酒香浓郁、醪液充沛、清澈半透明和甜醇爽口的。实验5-2甜酒酿的酿制

五、实验报告从甜酒酿的外观（酒酿醅团块、醪液量及色泽和粘稠度等）和香味、口感等方面记录和评估自己实验的质量。注意事项淘洗的糯米要待充分吸水后隔水蒸煮熟透，使饭粒饱满分散，利于接种后的根霉孢子能在疏松通气的条件下良好地生长繁殖，使淀粉充分糖化。返回实验5-3谷氨酸发酵

一、实验目的

1.了解谷氨酸发酵的工艺过程。

2.学习用纸上层析法与比色法对谷氨酸进行定性与定量测定。二、实验原理利用细菌生产谷氨酸是微生物好氧发酵的一个很典型的代表，谷氨酸发酵主要采用糖质原料，也可以用乙酸或乙醇等作原料。在使用糖质作原料时，葡萄糖在谷氨酸产生菌的各种酶系作用下，经己糖酵解、单磷酸己糖、三羧酸循环、乙醛酸循环等途径生成谷氨酸、CO2和水。实验5-3谷氨酸发酵

谷氨酸生产菌主要是棒杆菌属、短杆菌属、微杆菌属和节杆菌属的细菌。目前生产上用得较多的是优良菌株黄色短杆菌T6-13。由斜面试管保藏的原菌出发，要繁殖成能够供大规模生产所需的数百以至数千升种子的数量，必须经过若干次扩大培养后才能达到。一般的扩大培养工艺流程为：试管斜面原菌→试管斜面活化培养→三角瓶摇床培养(一级种子)→种子罐培养(二级种子)。本实验中使用一级种子。实验5-3谷氨酸发酵

三、实验材料

1.菌种黄色短杆菌T6-13。

2.培养用原材料葡萄糖，玉米浆，尿素，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸锰，硫酸亚铁，琼脂。

3.仪器和试剂接种环，酒精灯，试管，三角瓶，烧杯，恒温培养箱，恒温培养室，摇床，分光光度计，层析缸，新华一号滤纸，标准谷氨酸，0.5%茚三酮，正丁醇，甲酸，氨水，乙醇，硫酸钠。实验5-3谷氨酸发酵

四、实验方法

1.T6-13菌种的扩大培养

(1)培养基的制备①试管斜面培养基葡萄糖0.1%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH6.8～7.2。除琼脂外，先将其余各成分溶解于水，调整pH后加入琼脂并使之融化，分装试管，一般培养基的装量是试管容量的1/5。以111℃蒸汽灭菌10min，取出后趁热制成斜面，放冷，斜面的长度为试管长度的1/2～3/5。实验5-3谷氨酸发酵

②三角瓶扩大培养基葡萄糖2.5%，玉米浆2.5%，尿素0.5%，磷酸氢二钾0.15%，硫酸镁0.04%，硫酸锰2mg/kg，硫酸亚铁2mg/kg，pH7.0。

(2)接种与扩大培养①将试管斜面T6-13菌种接种于试管活化斜面培养基上，以30～33℃培养24h。②将培养好的斜面菌种接一环于三角瓶扩大培养基中，32～34℃摇床振荡培养10～12h。实验5-3谷氨酸发酵

2.谷氨酸发酵试验

(1)培养基的制备同种子培养基的制备。将制备好的灭菌培养基在无菌条件下分装于已经灭过菌的500mL三角瓶中，每瓶装100mL。

(2)接种与发酵将培养好的成熟种子接种于上述发酵培养基中，接种量为1%～2%。发酵温度控制：0～16h为32～34℃，16h后为34～36℃。发酵液pH控制：0～12h为7.1～7.4，12～28h为7.1～7.3，28h后适当降低，一般为7.0以下，收瓶前为6.4～6.7。发酵时间控制：34～36h。实验5-3谷氨酸发酵

3.谷氨酸定性鉴定用纸上层析法定性测定发酵产物中的谷氨酸。

(1)展开剂配方酸向展开：正丁醇∶88%甲酸∶水=15∶3∶2

碱向展开：正丁醇∶12%氨水=13∶2

(2)显色剂：0.5%茚三酮。

(3)以标准谷氨酸与样品相比。实验5-3谷氨酸发酵

4.谷氨酸定量测定(用比色法)

(1)将上述定性测定的层析斑点剪下，投入盛有6mL洗脱剂的容器中(75%乙醇39份+0.2%硫酸钠1份)，洗脱1h。将洗脱液在波长520nm处进行比色。

(2)以同一滤纸上无斑点处剪一块与层析斑同样大小的滤纸做空白对照，用同样的方法进行洗脱处理。

(3)绘制标准谷氨酸工作曲线。①点样：取10cm×10cm新华一号滤纸，在距底边2cm处用铅笔画一直线，在直线上每隔2cm处，分别以2、4、6、8、10µL标准谷氨酸准确点样。实验5-3谷氨酸发酵

②依法进行展开、显色、洗脱、比色。③以所测得的光密度为纵坐标，以谷氨酸的含量为横坐标做图，即得谷氨酸工作曲线。五、实验报告绘制标准曲线，记录实验结果，并计算谷氨酸的产量。返回实验5-4乙醇发酵试验

一、实验目的

1.熟识酵母菌的扩大培养技术。

2.掌握淀粉质原料发酵乙醇的技术。

3.学会测定乙醇发酵力的方法。二、实验原理在无氧条件下，酵母菌利用己糖发酵生成乙醇和CO2的作用，称为乙醇发酵。目前乙醇发酵所采用的微生物主要是酵母菌。生产上所使用的酵母菌原菌一般是固体斜面试管菌种，由于其酵母数量太少，不够生产之需，所以必须将斜面菌种进行若干次的扩大培养，以获得含有足够数量酵母菌的酵母培养物，以供乙醇发酵之用，故被称为酒母。实验5-4乙醇发酵试验

本实验由于所用的发酵容器是三角瓶，故采用的扩大培养流程为：固体斜面试管原菌—→固体斜面试管活化菌种—→液体试管培养—→小三角瓶培养—→大三角瓶发酵。酵母菌的厌氧乙醇发酵是生产乙醇及各种酒类的基础，因此学会乙醇酵母的扩大培养技术及其乙醇发酵方法是发酵微生物学的一项重要任务和基本功。另外，通过测定发酵过程中CO2生成量和最终产物乙醇的生成量，可以测定酵母的发酵能力。实验5-4乙醇发酵试验

三、实验材料

1.菌种K氏酵母菌或1308号酵母菌。

2.试验用原材料麦芽，甘薯粉或木薯粉，细菌淀粉酶，琼脂。

3.仪器设备接种环，酒精灯，试管，三角瓶，烧杯，水浴锅，恒温培养箱，蒸馏烧瓶，冷凝管，牛角管，容量瓶，量筒，电炉，石棉铁丝网，0～30%(体积分数)乙醇，0～50℃温度计，0～100℃温度计。实验5-4乙醇发酵试验

四、实验方法

1.酵母菌的扩大培养

(1)培养基的制备酵母扩大培养中的试管和三角瓶培养用的培养基通常采用麦芽汁，其制备方法如下：将干麦芽磨碎，加入3.5倍量的65℃的热水，在58～60℃的温度下糖化3～4h，以碘液检查糖化完全后，将其煮沸、过滤，将滤液浓度调整到13oBx。实验5-4乙醇发酵试验

将上述制备好的麦芽汁进行分装并灭菌：①固体斜面试管培养基：取100mL麦芽汁，加入2%琼脂，融化后分装试管，一般培养基的装量是试管容量的1/5。以121℃蒸汽灭菌20min，取出后趁热置成斜面，放冷，斜面的长度为试管长度的1/2～3/5。②液体试管培养基：用稀硫酸将麦芽汁pH调节至4～4.4，分装于试管中，每支试管装5mL。以121℃蒸汽灭菌20min。③小三角瓶培养基：将pH调节至4～4.4的麦芽汁分装于容量为150mL的三角瓶中，每瓶装50mL。以121℃蒸汽灭菌20min。

实验5-4乙醇发酵试验

(2)接种与扩大培养①将斜面试管酵母原菌移接于固体斜面试管，于28～30℃下培养48h。②将上述培养好的斜面活化酵母菌种接一环于液体试管中，以28～30℃培养24h。③将上述液体试管酵母接种于小三角瓶中(每支试管接一个三角瓶)，以28～30℃培养至对数期末(约16h)。

(3)种子(酒母)质量要求对培养好的三角瓶种子要进行质量检查。镜检时要求酵母形态健壮整齐，细胞内原生质稠密，无杂菌；细胞数0.8～1.0×108个/mL，出芽率20%～30%，死亡率小于1%。

实验5-4乙醇发酵试验

2.淀粉原料的蒸煮与糖化

(1)按甘薯粉或木薯粉的3.5倍量的加水比，用50～55℃的温水与淀粉原料搅拌混合，添加原料量0.1%的细菌淀粉酶，于电炉上加热并不断搅拌，升温至90～93℃，保持5～10min，进行液化；继续加热煮沸lh，使淀粉充分糊化和液化，并适量补充水分。

(2)将上述蒸煮醪冷却至60～62℃，添加180u／g原料的糖化酶，用硫酸将醪液的pH调节至4～4.5，在水浴锅上保温糖化30min，而后分装于1000mL的三角瓶中，每瓶装糖化醪500mL。

(3)糖化醪的质量要求：糖度15～17°Bx，还原糖6%～9%，pH4～4.5。实验5-4乙醇发酵试验

3.糖化醪的发酵将培养成熟的小三角瓶酵母种子(酒母)以无菌操作接入装有500mL糖化醪的大三角瓶中(每个小三角瓶中接一个大三角瓶)，在30℃的温度下发酵68～72h。

4.CO2生成量的测定测定乙醇发酵中CO2生成量的装置如图5-1所示。其测定方法如下：

(1)发酵前，将三角瓶外壁擦干，置于1/100g的天平上称重，记下质量为m1。

(2)发酵完毕后，将三角瓶轻轻摇动，使CO2尽量逸出。在同一架天平上再称重，记下质量为m2。

(3)CO2生成量=m1－m2。实验5-4乙醇发酵试验

5.乙醇度的测定

(1)按图5-2所示安装好蒸馏装置。

(2)准确量取100mL发酵成熟醪倒入500mL蒸馏瓶中，并加入等量的蒸馏水。蒸馏瓶用插有温度计的胶塞塞紧，连接好冷凝管，勿使漏气。用电炉加热，同时接通冷却水，馏出液收集于100mL容量瓶中(如无容量瓶亦可直接用100mL量筒收集)。待馏出液达到刻度时，立即停止收集(注意：不能超过刻度)，倒入量筒中，稍加搅动，使之均匀，将酒精计与温度计同时置入量筒，测定酒精度与温度。

(3)根据测得的乙醇度与温度，查换算表，得到温度在20℃时的乙醇浓度。实验5-4乙醇发酵试验

图5-1测定CO2生成量的装置图5-2蒸馏装置

实验5-4乙醇发酵试验

五、实验报告

1.记录镜检酒母时看到的酵母形态，有无杂菌污染，酵母菌的数目。

2.发酵试验中测得的CO2生成量。

3.蒸馏液的乙醇度，换算成标准温度20℃的乙醇度。

返回实验5-5阿维菌素的发酵

一、实验目的学习阿维菌素的发酵过程二、实验原理阿维菌素的发酵共分三大工序：菌种、发酵、提取。配合三个工序进行分析化验和有关产物测定。衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。本实验采用高效液相色谱法测定抗生素的效价。实验5-5阿维菌素的发酵

三、实验材料

1.菌株阿维菌素链霉菌斜面菌种。

2.培养基培养阿维菌素链霉菌所用的斜面培养基、分离培养基、种子培养基、发酵培养基。见附录Ⅲ。

3.仪器及药品接种环，培养皿，三角瓶，摇床，离心管，高效液相色谱柱，漩涡振荡器，微孔滤膜，淀粉酶，丙酮，乙酸乙酯，无菌水。实验5-5阿维菌素的发酵

四、实验方法

1.实验用菌种的制备（1）单孢子悬液的制备向阿维菌素链霉菌孢子斜面中加入10mL无菌水，用接种环刮取孢子，震荡打碎，过滤得到单孢子悬液。（2）自然分离将得到的单孢子悬液稀释，分别涂布于含有分离培养基的平皿中，在28℃条件下培养7～9天。实验5-5阿维菌素的发酵

2.发酵培养基和待检测发酵液样品的制备（1）水解淀粉的制备称取玉米淀粉200g，先加入少量水混合均匀，加热使其糊化，降温至60℃，然后在糊化的淀粉液中加入0.6g的淀粉酶，恒温搅拌10min，最后加热至沸腾状态，保温5min，使残留的淀粉酶失活，降温待用。（2）液体发酵铲取面积为0.5×0.5㎝2大小的斜面培养物，将其接种至种子瓶的培养基中，28℃摇床培养22h后，按发酵摇瓶装料体积的5%接种至发酵瓶中，28℃培养9天。实验5-5阿维菌素的发酵

（3）检测发酵液中阿维菌素样品的制备取5mL摇瓶发酵液于离心管中，3000r/m离心10min，弃去上清夜。在发酵液的沉淀物（菌丝体）中加入2mL丙酮，在漩涡式混合器上震荡1min，静置10min，如此重复3次。然后加入3mL乙酸乙酯，震荡1min，静置10min，3000r/m离心10min，最后小心地吸取其中的上清夜作为样品，待检测。实验5-5阿维菌素的发酵

3.阿维菌素含量的测定利用高效液相色谱法（HPLC）检测（1）HPLC条件色谱柱：KromasilC185µm200×4.6mm流动相：CH2OH∶H2O﹦88∶12(V/V)流速：1.0mL/min检测波长：244nm（2）标准曲线的测定配制一系列不同浓度的阿维菌素B1标准溶液（500～3000µg/mL），分别取各浓度标准溶液的过滤液5µL注入高效液相色谱仪中，测定其吸收峰值面积，然后对浓度（Y）和吸收峰面积（X）进行一元线性回归，得到一元线性回归方程。

实验5-5阿维菌素的发酵

（3）效价的计算方法将乙酸乙酯萃取所得的上清夜用0.45µm的微孔滤膜过滤，准确吸取滤液5µl注入HPLC中，记录色普图，将B1峰面积代入上述的回归方程中，计算得到发酵液中B1组分发酵单位（µg/mL）。

4.发酵液中菌体浓度的计算取体积为V1（mL）的发酵液，3000r/m离心10min后，得到上清夜的体积计量为，V2（mL），那么发酵液的菌体浓度为：菌体浓度＝[（V1－V2）/V1]×100%五、实验报告绘制标准曲线，并记录实验结果。返回实验5-6单细胞蛋白的生产

一、实验目的了解单细胞蛋白的生产原理和单细胞蛋白的培养方法。二、实验原理单细胞蛋白是通过培养单细胞微生物获得的菌体蛋白质。酵母菌、丝状真菌、微型藻类及非病源细菌等单细胞微生物均可用于生产单细胞蛋白，其中酵母菌是生产单细胞蛋白的主要单细胞微生物。多种原料可用于生产单细胞蛋白，如秸秆、薯干、石油、甲烷等，特别是一些工业废水、废渣可用来生产单细胞蛋白饲料，废物利用有利于环保。实验5-6单细胞蛋白的生产

三、实验材料

1.菌种啤酒酵母。

2.菌种活化培养基黄豆芽10g，100mL水，煮沸30min,过滤，滤液加5g蔗糖，加水至100mL。

3.试剂废水，琼脂，蔗糖，尿素，磷酸二氢钾。

4.器材接种环，无菌吸管，电磁搅拌器，离心机，摇床，超净工作台，高压灭菌锅。实验5-6单细胞蛋白的生产

四、实验方法

1.菌种活化用接种环将啤酒酵母菌种接入盛有35mL菌种活化培养基的三角瓶中，30℃摇床培养17～19h。

2.大量培养量取废水加入锥形瓶中，加入0.5%的尿素和磷酸二氢钾，调节pH6。用无菌吸管将活化的菌种0.5～1mL接入10mL上述废水溶液，30℃摇床培养24h。

3.集单细胞蛋白将培养后的啤酒酵母悬液在3000r/min条件下离心8min，所得沉淀在95～105℃条件下烘干2h，即得产品。称重。五、实验报告记录单细胞蛋白的产量。返回实验5-7纤维素的分解

一、实验目的

1.了解能分解纤维素的微生物种类。

2.了解环境中纤维素分解菌的种类及其降解能力。二、实验原理每年均有大量纤维素物质作为废弃物进入环境。纤维素的分解是自然界碳素转化的重要环节。分解纤维素的微生物种类甚多，本实验是主要培养并观察在中温有氧与缺氧条件下分解纤维素的微生物以及滤纸纤维素被分解的现象。实验5-7纤维素的分解

三、实验材料

1.培养基赫氏噬纤维菌基础培养基，厌氧性分解纤维素细菌培养液。（见附录III）

2.菌源菜园土、河沟底泥或水稻土。

3.其他液体石蜡，直径9cm的无菌圆形滤纸。四、实验方法

1.接种

(1)取无菌圆滤纸二张，分别置于二个赫氏纤维菌基础培养基平板上，贴紧。

(2)取厌氧性分解纤维素细菌培养液二管。一管不接种，一管接入少许河底泥或水稻土。实验5-7纤维素的分解

2.培养将上述培养皿置28～30℃，培养7～10天；上述试管置33～37℃，培养10～15天。

3.观察

(1)滤纸被分解的情况：注意滤纸出现斑点或变薄，分解旺盛时可见到滤纸彻底溃烂状。制片染色观察：土粒周围常长出深黄、金黄或黄绿色菌落，取带黄色粘液的纤维少许于载玻片上，加无菌水一滴，将纤维散开，干燥固定，用齐氏石炭酸复红染色。实验5-7纤维素的分解

(2)试管滤纸条上常可见灰色半透明或黄色斑块的纤维溶解区，即为厌氧性分解纤维素细菌菌落，同上述制片染色。油镜下观察，常可见一种长杆菌，形成芽孢时，细胞末端膨大成鼓锤状，此即分解纤维素能力很强的奥氏梭菌。五、实验报告

1.描述(接种与不接种)培养皿及试管中滤纸的分解情况。

2.绘图并记录需氧及厌氧分解纤维的微生物的形态。

返回实验5-8有机磷农药的生物降解

一、实验目的

1.掌握微生物的驯育技术。

2.了解微生物对有机磷农药降解速率测定方法。二、实验原理对硝基酚在碱性条件下以盐的形式存在，在波长410nm处有强烈吸收峰，能够通过分光光度计定量检测。本实验是以对硝基酚的生成量为指标，测定微生物对该有机磷农药的降解速率。实验5-8有机磷农药的生物降解

三、实验材料

1.菌种sp.CTP－01(可由中国科学院水生生物研究所提供)。

2.培养基Burk无机盐培养液

3.试剂5%对硫磷溶液，0.29%对硫磷溶液（对硫磷用丙酮配制），对硝基酚标准液(贮液)，对硝基酚工作液（见附录Ⅴ），14%NaOH溶液。

4.仪器分光光度计，离心机，电动搅拌器，恒温水浴，通气泵，摇床等。

5.其他2000mL玻璃缸，250mL三角瓶，试管，吸管等。实验5-8有机磷农药的生物降解

四、实验方法

1.菌体的驯育与收集

(1)将Ps.CTP－01的斜面菌种接入装有100mLBurk培养液的三角瓶中，加入0.01mL5%对硫磷溶液。置摇床上30℃培养5天。

(2)将培养5天的菌液全部接种于装有2000mLBurk培养液的玻璃缸中，加入0.5mL对硫磷溶液。在通气、搅拌条件下，30℃保温培养。

(3)细菌生长过程中，由于对硫磷被细菌利用，使培养液颜色变黄，待黄色消失，再补加lmL5%对硫磷溶液。严格控制培养液的pH值，使其保持在7.5左右。实验5-8有机磷农药的生物降解

(4)如果培养物生长迅速，可以观察到培养液的颜色变化很快，就必须适当增加对硫磷补加量，一次可加入对硫磷原油1～3滴。按(3)的步骤反复补加与培养。直到培养液的混浊度在分光光度计波长500nm时，光密度达到0.2左右。

(5)离心收集菌体，转速为4000r/min，离心20分钟，收集菌体称其湿重，并重新悬浮于50mL新鲜Burk无机盐培养液中，定容至50mL，于4℃保存备用。实验5-8有机磷农药的生物降解

2.对硫磷降解速率的测定

(1)取试管4支，分别加入l0mLBurk培养液及0.1mL0.29%对硫磷溶液，将试管于30℃恒温水浴上保温10分钟。

(2)将其中3支试管分别加入0.2mL菌液，另1支加0.2mLBurk培养液，在加入菌液的同时开始计算反应时间，反应20分钟。

(3)反应过程中经常摇动试管。

(4)反应结束应立即在分光光度计波长410nm时读其光密度值。以未加菌液的试管为空白对照。

(5)结果取三个平行试验的平均值。实验5-8有机磷农药的生物降解

3.对硝基酚：标准曲线的制备：将对硝基酚工作液稀释至8.34×10-4、6.95×10-4、5.56×10-4、4.17×10-

4、2.78×10-4、1.39×10-4mg/L的浓度，注意凋节pH至7.5。以蒸馏水为对照，在分光光度针波长410nm时测各稀释液的光密度值(OD)。将测定结果绘制标准曲线，并求出曲线的斜率K。实验5-8有机磷农药的生物降解

4.对硫磷降解速率计算：反应液体积：培养液+底物量+菌液量菌体量：加入菌液的mL数换算成菌体的湿重实验5-8有机磷农药的生物降解

五、实验报告将本次测试结果填入表5-1中。表5-1测试结果试管编号处理步骤1234Burk培养液（mL）0.29%对硫磷（mL）菌液量（mL）反应时间（min）OD410降解速率返回实验5-9活性污泥中菌胶团及生物相的观察

一、实验目的

1.观察活性污泥（或生物膜）的微生物种类及性状。

2.测定污泥沉降比及活性污泥（或生物膜）中动物的数目。

3.初步判断污水处理的运行状况是否正常。二、实验原理活性污泥中生物相较复杂，以细菌，原生动物为主。还有真菌、后生动物等。某些细菌能分泌胶粘物质形成菌胶团，进而组成污泥絮绒体（绒粒）。实验5-9活性污泥中菌胶团及生物相的观察

三、实验材料

1.活性污泥（或生物膜）取自污水处理厂曝气池

2.其他量简（100mL），载玻片，盖玻片，滴管，镊子，计数板等。

3.仪器显微镜采用厚玻璃割成9cm长，4cm宽的长方形，玻璃厚度以0.3～0.4cm为宜。利用氢氟酸腐蚀法，使玻板中央刻上10×10=100个小方格，小方格的大小没有严格规定，只要一片大号盖玻片能盖格子有余和便于在显微镜下计数就可以了。用大号盖玻片切成宽约0.7cm的玻条，用阿拉伯树胶粘在计数用的小方格的四周，便呈一周凸起的边框。这样，就制成了一块微型动物计数板，如图5-4、图5-5。实验5-9活性污泥中菌胶团及生物相的观察

图5-4微型动物计数板

图5-5微型动物计数板(侧视)

1-盖玻片2-计数室

1-盖玻片；2-计数板；3-凸起的边框；4-稀释液

实验5-9活性污泥中菌胶团及生物相的观察

四、实验方法

1.测污泥沉降比（SV30）肉眼观察，取曝气池的混合液置于100mL量筒内，直接观察活性污泥在量筒中呈现的絮绒体外观及沉降性能。

2.观察活性污泥生物相（1）制备水浸片取活性污泥混合液1～2滴于载玻片上，加盖玻片制成水浸标本片。（2）低倍镜观察观察生物相的全貌，要注意污泥结构松紧程度，菌胶团和丝状菌的比例及生长状况，观察微型动物的种类及活动状况。实验5-9活性污泥中菌胶团及生物相的观察

①污泥絮粒污泥絮粒性状是指污泥絮粒的形状、结构、紧密度及污泥中丝状菌的数量。镜检时可把近似圆形的絮粒称为圆形絮粒，与圆形截然不同的称为不规则形状絮粒。絮粒中网状空隙与絮粒外面悬液相连的称为开放结构；无开放空隙的称为封闭结构。絮粒中菌胶团细菌排列致密，絮粒边缘与外部悬液界限清晰的称为紧密的絮粒；边缘界线不清的称为疏松的絮粒。实验5-9活性污泥中菌胶团及生物相的观察

②丝状微生物活性污泥中的丝状菌数量是影响污泥沉降性能最重要的因素。当污泥中丝状菌占优势时，可从絮粒中向外伸展，阻碍了絮粒间的浓缩，使污泥SV30值和SVI值升高，造成活性污泥膨胀，根据污泥中丝状菌与菌胶团细菌的比例，可将丝状菌分成如下五个等级：0级：污泥中几乎无丝状菌存在；±级：污泥中存在少量丝状菌；