土壤微生物分离纯化及鉴定

EM原液中细菌的计数、分离纯化、形态分析及鉴定摘要】此次实验通过稀释涂布、划线分离等微生物实验的基本操作方法对EM原液中的细菌进行分离纯化，然后观察记录菌落形态和显微镜下细菌的形态特征，结合革兰氏染色结果，对分离出的细菌进行鉴定。实验最终得到芽孢乳杆菌属，芽孢杆菌属，梭菌属，肠杆菌属，葡萄球菌属等几种细菌的菌种。关键词】细菌，稀释涂布，分离纯化，形态分析，关键词】细菌，稀释涂布，分离纯化，形态分析，鉴定。【前言】此次实验从EM原液中分离得到芽抱乳杆菌属，芽抱杆菌属，梭菌属，肠杆菌属，葡萄球菌属等几种细菌。已皿菌(EffectiveMicroorganisms)为有效微生物群的英文缩写，也被称作EM技术。它由光合细菌、乳酸菌、酵母菌、芽抱杆菌、醋酸菌、双歧杆菌、放线菌七大类微生物中的10属80种微生物共生共荣，这些微生物能非常有效地分解有机物。它是由世界著名应用微生物学家日本琉球大学比嘉照夫教授在20世纪70年代发明的，EM技术是目前世界上应用范围最大的一项生物工程技术。只要使用恰当，它就会与所到之处的良性力量迅速结合，产生抗氧化物质，消除氧化物质，消除腐败，抑制病原菌，形成良好的生态环境。在种植、畜牧、水产、环保、饲料、人体家庭保健等方面都有显著作用。它具有改良土壤、增强光合作用、改善水质、除臭粪、促生长、抗病、改善畜禽品质、抑菌等功效。比嘉照夫用“优势原则”来解释EM菌的有效性。EM菌可以分成三组：积极微生物(再生(regeneration)),消极微生物(分解，退化(decomposition,degeneration))以及机会主义微生物。在不同的环境中(水，土壤，空气或人的肠道)，“积极”和“消极”微生物的比例是至关重要的，由此机会主义微生物就顺应再生或者退化的趋势。比嘉照夫相信由于微生物的这种特性对不同环境有着积极的影响。和一般生物制剂相比，它具有结构复杂、性能稳定、功能齐全的优势，表现出前所未有的高科技水平。迄今为止，EM已狂风般席卷日本、美国、巴西、法国、台湾等90多个国家和地区。细菌种类繁多。从复杂的微生物群体中获得只含有一种或一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。通过稀释涂布平板法可以在平板上获得单菌落，再通过挑取单菌落进行平板划线分离可获得纯培养。在稀释涂布平板法中还可通过平板菌落计数，推算单位EM原液中含有的细菌的数量。对微生物分类的主要依据有形态特征、生理生化特征等。形态特征包括个体形态和培养形态，这些特性可被用作细菌的分类和鉴定。1.材料与方法1.材料与方法1.1材料1・1・1菌液：EM菌原液(EffectiveMicroorganisms)1・1・2试剂：革兰氏染色用卢戈氏碘液，结晶紫染液，95%乙醇，0.5%番红染液，5%孔雀绿染液，0.1%吕氏碱性美蓝染液。1・1・3仪器和其他用品：试管，平皿，移液管，烧杯，三角瓶，玻璃珠，量筒，玻璃棒，天平，pH试纸，高压蒸汽灭菌锅，电热套，载玻片，盖玻片，镊子，接种环，酒精灯1.2.方法1.2.方法1.2.1实验准备准备实验所需仪器与药品，按照配方配配方如下：蛋白胨10g,酵母膏5g,氯化钠(NaCl)5g,水1000ml配制LB培养基。pH调节到7.0。并对仪器和培养基进行灭菌。1.2..2梯度稀释1・2・2・1无菌操作，移取lmlEM菌原液至带玻璃珠的无菌90mL无菌水的三角瓶中，充分摇匀20min,将菌分散。1・2・2・2用移液管吸取上述菌液1毫升,放入盛有9毫升无菌水的试管中，使之充分混合，稀释成10-3倍的菌液。按此十倍稀释法依次稀释出10-4、10-5、10-6倍浓度的梯度稀释液。1・2・2・3分别从10-4、10-5、10-6倍的菌液中吸取1毫升菌液，注入培养皿内，用三角刮刀将菌液涂布均匀，同一稀释液重复涂布3个培养基，并对培养基进行编号记录。1.2.2.4将培养皿倒置在36°C恒温箱中培养2天。1・2・2・5经过一定时间培养后，观察并记录菌落形态特征。1・2・3计数对平板上的菌落数量进行计数。同一梯度取三个平板菌落数的平均值。1・2・4划线分离从平板中挑取单个细菌菌落，注意选择形态特征有明显差异的菌落。在LB培养基上进行划线分离。2结果与分析1・2・5斜面接种保藏菌种无菌操作，从画线后的培养基上挑取单个菌落，在准备好的试管斜面上划线接种。斜面置于36C恒温箱中培养。1・2・6观察与鉴定1・2・6・1观察：取分离出的细菌菌种制成美蓝水浸片，将制片放置3分钟后，用高倍镜观察并记录细菌的形态特征。1・2・6・2细菌大小的测量先校正目镜测微尺，计算出目镜测微尺每格所代表的长度。将细菌制成美蓝水浸片。在显微镜下测量细菌大小，并记录。1・2・6・3细菌的革兰氏染色对分理出的菌种分别进行革兰氏染色。革兰氏染色步骤：制片、固定，草酸铵结晶紫初染1-2分钟，去掉浮色。用碘液媒染1分钟，后倾去多余溶液。用乙醇(95%)脱色20-30秒。蕃红复染2min,水洗，吸取残水晾干。干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。1・2・6・4细菌芽孢染色按常规方法涂片、干燥、固定，滴加孔雀绿染液，用酒精灯加热染色，倾去染液，水洗至不褪色为止，用0.5%番红水溶液复染2min水洗至流出水无色。镜检。2・1结果表1-1：菌液计数稀释倍数及菌落数EM原液中含有的细菌群落总数cfu/ml报告方式cfu/ml（取两位有效数字）10-410-510-61842642543332.5x106276302389295平均83284表1-2：菌落形态的观察记录菌洛编号1号2号3号4号5号菌落直径/mm1~23〜42~32~32~3菌落形态圆点圆点圆点圆点圆点菌落是否突起是是是是是菌落颜色乳白白色白色白色黄色菌落边缘均匀均匀均匀光滑均匀菌落干湿半湿半湿干燥半湿半湿菌落是否透明否否否否否图1：第1、3、5号菌落图示表1-3：细菌大小测定记录

菌洛编号12345、亠化弋厶a口试官编号12345678910长度/卩m1.5289341.20.80.50.7宽度/卩m111.21.50.30.50.40.40.50.7图22号试管菌种的革兰氏染色结果图3图4：图22号试管菌种的革兰氏染色结果图3图4：9号试管菌种的革兰氏染色结果图56号试管菌种的芽孢染色结果表1-4：染色结果记录试管编号12345678910革兰氏染阳性阳性阳性阴性阳性色结果芽抱染色圆形芽抱芽抱居中卵圆形芽无芽抱无芽抱结果居中不膨不膨大抱在顶端大膨大2.2菌种鉴定根据上述结果，对照《伯杰细菌鉴定手册》，初步鉴定出各株细菌分别为：1、2号为芽抱乳杆菌属(SporolactobacilluS,3、4号为芽抱杆菌属(Bacillus),5、6号为梭菌属(Clostridian),7、8号为肠杆菌属(Enterobacter)9、10号为葡萄球菌属(Staphylococcu)。无法具体鉴定到种。2.3实验结果总结各属细菌特点：芽抱乳杆菌属(SporolactobacilluS：直杆菌，0.7〜0.8》mX3〜5》m。单个，成对，罕见短链。革兰氏染色呈阳性，以周生鞭毛运动。芽孢产生稀少，椭圆形，中生，膨大。兼性厌氧，但在大气中生长贫乏。糖类同型发酵产D-乳酸。不产接触酶和氧化酶。最适温度35°C,从鸡饲料和土壤中分离到，也可能广泛分布于环境中。芽抱杆菌属(Bacillus)：细胞呈直杆状，0.5〜2.5》mX1.2〜10》m，常以成对或链状排列，具圆端或方端。细胞染色大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生鞭毛运动。芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。每个细胞产一个芽抱，生抱不被氧所抑制。好氧或兼性厌氧，具有对热、pH和盐各种多样性的生理特性。化能异养菌，具发酵或呼吸代谢类型。梭菌属(Clostridian)细胞杆状，0.3〜2.0》mX1.5〜2.0》m,常排列成对或短链，圆的或渐尖的末端。通常多形态，幼龄时革兰氏常呈阳性，以周生鞭毛运动。芽孢椭圆或球形孢囊膨大。大多数种为化能异养菌；有的化能自养菌或无机化能营养。可以水解糖、蛋白质，或两者都无或两者皆有。肠杆菌属(Enterobacter)细胞直杆状，宽0.6〜1.0》mX1.2〜3.0》m，符合肠杆菌科的一般定义。革兰氏阴性，周生鞭毛(通常4〜6根)运动。兼性厌氧，容易在普通培养基上生长。发酵葡萄糖，产酸产气(通常CO2:H2=2：1)。在44.5C时不能由葡萄糖产气。大多数菌株VP试验阳性，MR试验阴性。最适生长温度为30C，多数临床菌株在37C生长，有些环境菌株37C时生化反应不稳定。广泛分布于自然界，普遍存在于人和动物中。葡萄球菌属(Staphylococcu)：因排列成葡萄串状而得名。单个或成双存在，革兰氏阳性，菌体直径0.5〜1.5微米，无鞭毛,无芽胞，无荚膜，兼性厌氧,过氧化氢酶阳性。营养要求不高，适温37C,多数菌株能产生脂溶性色素,DNA中的G+C克分子含量为30〜40%。分布很广,人或动物的体表以及与外界相通的腔道中都有存在。本属有金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生性葡萄球菌3种。3小结通过这一学期的微生物实验课程，我们对微生物有了更深入的了解。特别是经过实际动手做微生物实验之后，我们掌握了基本的微生物培养、分离、纯化与鉴别的技能，为今后深入学习微生物知识打下基础。因为大多微生物体积微小，肉眼无法识别，我们在实验过程中学习通过菌落形态，和利用显微镜来观察微生物。也正是因为微生物的微小与适应性强，所以，对微生物的培养也较为繁杂。操作中要特别注意无菌操作，以免杂菌污染。在本次试验中，我们重做了两次，才得到较为理想的菌种。此次微生物