脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识

脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量治理专家共识脂肪组织来源的干细胞(adiposetissue-derivedstromal/stemcells，ASCs)是从脂肪可多向分化等优点。ASCs在人体修复重建、免疫调整及组织再生等方面的应用成为近年来干细胞争论的重要内容，也是组织工程及再生医学的争论热点。大量争论说明，自体脂肪组织移植到软组织缺损部位后，其中40%~60%会被吸取，自体脂肪组织结合ASCs移植，能明显削减自体脂肪组织移植的吸取、液化、坏死及纤维化等规模的ASCs提取、制备、储存，为再生医学供给种子细胞。目前，国内外尚缺乏ASCs提取、分别、制备及储存的标准和质量治理标准，导致各制备机构或争论应用机构之间无法进展统一评估和沟通，严峻制约了ASCs在皮肤软组织修复重建等相关领域的进展。为了建立安全、标准、稳定、可追溯的行业共识、指南及标准，从源头保证ASCs的提取、制备、储存的高质性和安全性，中国医药生物技术协会皮肤软组织美容外科等多学科的专家，参照中国医药生物技术协会《细胞库质量治理标准》制剂制备质量治理自律标准》，组织起草脂肪组织采集及ASCs制备、检测、储存的标准和质量治理专家共识，旨在促进ASCs在皮肤软组织修复重建技术等领域争论成果的转化，进一步促进多学科的沟通和进展。脂肪组织采集脂肪组织采集机构要求程(standardoperationprocedure，SOP)，并备有采集过程中的应急预案。采集过程应在层流手术室内进展无菌操作，最大限度地削减污染和穿插感染的发生。脂肪组织供者要求病史、无恶性肿瘤、无急慢性传染病及血液系统疾病；血常规及分类、肝肾功能正常；人源性特定病毒(包括但不仅限于HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)阴性、梅毒螺旋体阴性(供给脂肪组织的同时，另需供给不少于8ml外周血用于复检，ABO血型、HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分型检查，以备追溯性查询)。假设供者HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV检查结果为阳性，关物品可经过灭活处理后再移出该区域一设备，方可进展脂肪组织的采集，但必需使供者知情，同时通知接收、制备、质控及医护人员等做好防护措施。当试验室不具备上述相对应病原体阳性制备/培育区时，不得采集上述阳性供者的脂肪组织。假设供者HIV、梅毒螺旋体检查结果为阳性时，不得采集供者的脂肪组织。高度疑心HIV感染或者考虑HIV感染窗口期的供者不予采集。采集方式、采集部位和采集量采集方式用肿胀液(生理盐水250ml＋2%利多卡因10~15ml＋肾上腺素0.25mg)局部浸润麻醉供20ml注射器配备口径1.5~3.5mm3.0~5.0mm形成负压，呈扇形手动均匀吸取脂肪组织，吸出3~5mm3脂肪组织颗粒，假设脂肪组织颗粒较大，则需要进展手工剪制。采集部位排解肿胀液，进展适当的加压包扎，24~48h后更换包扎敷料，预防感染，7d针眼或切口愈合。采集量(脂肪组织，肿胀液除外)女性≤45岁，男性≤50岁，脂肪组织采集量不少于50ml。女性45~55岁、男性50~60岁者不少于80ml。男性体脂＞25%、腰围＞100cm，女性体脂＞33%、腰围＞88cm，不少于100ml。体脂率=[1.2×BMI+0.23×年龄－5.4－10.8×性别系数(男=1，女=0)]。女性＞55岁，男性＞60岁，或者近期服用减肥药者不建议采集脂肪组织提取ASCs。脂肪组织运输和接收48h内，送达制备机构。制备机构应设置脂肪组织的接收取样工作区，执行登记、初检、核规程。ASCs的制备与储存制备机构或争论应用机构应建立相应完善的SOP号、质量检定合格报告，应尽可能承受GMP临床应用级别的原料或国家已批准的可临床应用的产品，相关制备、生产记录及留样应至少保存至使用完毕后3个月。制备人员应当经过特地的技术培训，ASCs的制备建议在B级背景下A级干净度级别的环境中进展。脂肪干细胞的分别议GMP级)或胰蛋白酶混合液，37℃水浴或气浴振荡，离心，吸弃上层脂肪和液体层，参加获得基质血管成分(stromalvascularfraction，SVF)。SVF/干细胞时间、细胞数量和活性等。脂肪干细胞的培育与传代接种SVF至培育瓶中，培育条件为5%CO、37℃常规培育，保持湿度。细胞融合度达2到70%~80%时可以传代，收集消化的细胞悬液，接种至培育瓶中，传代培育，培育基应使胞数量等。建立脂肪干细胞种子细胞库收集P2或P3代细胞，做质量检测和性能指标检测(包括细菌、支原体、内外源病毒、细(2~3)×106个/ml，分装至细胞冻存管中，贴标签，标注细胞数量、冻存日期及代次等。将冻存管程序降温后，转入–196℃液氮保存，即为种子细胞库，供建立工作细胞库用。填写细胞操作记录，包括时间、批次、细胞数量、冻存数量等。建立脂肪干细胞工作细胞库经脂肪干细胞种子细胞库传代增殖，将传至P5代的细胞制成均质细胞悬液，取样进展临床使用前的质量掌握和安全鉴定存于–196℃液氮中，即为工作细胞库。填写细胞操作记录，包括时间、批次、细胞数量、冻存数量等。工作细胞库的质量掌握和安全鉴定＞种子细胞库质量掌握和安全鉴定。脂肪干细胞冻存数量测用数量及复检频率等，依据个体的需要确定，遵循“够用原则”ASCs细胞制剂建议设1×107个ASCs为1个单位。填写细胞操作记录，包括时间、批次、细胞数量、冻存数量等。ASCs的运输ASC链运输，建议运输时间掌握在48h内。应建立ASCs污染或其他不良影响。每批次ASCs制剂的整个运输过程应有发运记录，并能够追踪。ASCs制剂，由制备机构进展合法和符合伦理要求的处置并记录存档。制备机构如托付第三方机构运输ASCs的第三方机构复核ASCs制剂运输。ASCs的质量安全性制备机构依据ASCs自身特性、临床争论状况，配备相关专业技术人员和设备，确立制质量受权人签字审核。根本性能ASCs的根本性能指标包括细胞形态、周期倍增时间、细胞活性、增殖、细胞表型、集落形成、端粒酶活性等。安全性能ASCs的安全性能指标包括微生物、内毒素、核型、致瘤性、毒性、残留物及人畜共患猪细小病毒检测，必要时包括病毒核酸检测，确保ASCs制剂临床应用的安全性。假设Asc承受胰蛋白酶消化,建议检测猪细小病毒。ASCs的分化功能测定向成骨细胞分化力量取对数生长的ASCs，参加成骨诱导液进展培育，第19天行茜素红染色，镜下观看。脂肪干细胞被茜素红染成红色，染色面积占总面积的比例≥50%。向成软骨细胞分化力量 取对数生长的ASCs，参加成软骨诱导液进展培育第14天行甲苯胺蓝或Ⅱ型胶原蛋白抗体进展染色分析，染色面积占总面积比例≥80%。向成脂肪细胞分化力量取对数生长的ASCs，参加成脂肪分化条件培育基，第12天行油红O染色，脂肪干细胞被油红O染成红色，染色面积占总面积的比例≥50%。ASCs的组织再生功能检测促血管形成功能用含100ml/LFBS的DMEM/F12培育体系将ASCs以1×105个/ml密度与脐静脉内皮细_胞共培育，4h后，镜下统计形成的血管环数≥37/10000个细胞。巨噬细胞极化 用含100ml/LFBS的DMEM/F12培育体系将ASCs以1×105个/ml密度与巨噬细胞共培育，24h后与巨噬细胞比照组相比用ELISA试剂盒检测上清中TNF-αIL-1β、TGF-β及IL-10的表达水平，其中TNF-α、IL-1β水平应下降，TGF-β、IL-10水平应上升，差异有统计学意义(P＜0.05)。抗凋亡功能ASCs培育24hASCsP＜0.05)。此三项内容建议为ASCs质量的参考指标，应为制备机构或争论应用机构ASCs争论内容。追溯应建立完整的ASCs制备记录系统、标识标签系统、ASCs细胞制剂编码系统，以便于辨识并防止制剂混杂。ASCs制备记录包括每天的细胞状况、细胞数量、培育条件等具体信息。标识系统应记录供者信息、脂肪组织收获日期及ASCs制备时间、细胞数量/体积、储存条件等。每份ASCs和最终处理的全部记录。转移和运输记录应能追溯ASCs由采集机构到制备储存机构的全部流转过程。参与制订专家共识人员：任史 康生物科技技术总监郑 岩：成都华美紫馨医学美容医院主任于卉影：原沈阳军区总医院生物医学试验室主任胞制备与存储学组组长陈惠华：北京恒峰铭成生物科技技术总监共识评审专家：夏照帆：中国工程院院士，海军军医大学全军烧伤争论所所长医学分会副会长，中国整形美容协会民营医疗机构分会副会长，PAAFRRS中国整形分会副主席杨 美紫馨医学美容医院院长，中华医学会整形外科分会肿瘤整形外科学组副组长，中华医学会整形外科分会血管瘤与脉管畸形学组副组长物芯片国家工程争论中心副主任：北京大学口腔医院副院长，中华医学会组织再生专业委员会常委马 洁：北京医院生物治疗中心主任(PI)王建华：首都儿科争论所生物技术争论室教授(PI)郝好杰：中国香港生命工程争论院首席教授胡灵敏：苏州般假设生物科技总经理姜笃银：山东大学其次附属医院烧伤整形科主任卢安军：银河生物江苏得康公司总经理庞希宁：中国医科大学干细胞与再生医学争论室主任3D打印技术