基于h-2基因的近交系小鼠遗传检测方法的建立

基于h-2基因的近交系小鼠遗传检测方法的建立

交叉移植是生物因素的经典实验方法。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。目前微孔板Southern杂交技术较传统的Southern杂交技术具备简捷、客观、灵敏等优点而得到突飞猛进的发展。我们利用该方法的优点,结合遗传检测工作的实际建立了近交系小鼠H-2Southern杂交检测技术,目前,该遗传检测技术在国内还未见报道。1材料和方法1.1实验动物的来源C57BL/6、C57BL/10、B6D2F1、DBA/2、BALB/c、Scid、615、C3H、NCPC/2、TA1、TA2、T739,12个品系的近交系小鼠均由北京国家啮齿类实验动物种子中心提供,实验动物生产许可证号SCXK(京)2000-0010。B6D2F1是根据需要利用雌性C57BL/6小鼠和雄性DBA/2小鼠杂交所得。1.2聚糖烷酮探针TaqDNA酶、蛋白酶K(20mg/mL)(5U/μL)购于宝生物公司(大连);聚蔗糖(Ficoll400)和聚乙烯吡咯烷酮购于Sigma公司;生物素标记的探针均由上海生工北京分公司合成;亲和素标记的辣根过氧化物酶购于华美公司。1.3实验方法1.3.1提取氨基酸基因的dna酚氯仿抽提法从鼠尾中提取上述12个品系小鼠的基因组DNA。1.3.2k型探针的结构H-2D区b型探针序列如下:35bpCCTCTCTTTAGGGACTTCGCGATGCACGACTAGACH-2D区k型探针序列如下:36bpTTTCTCTGTATAGCCCTGGCTGTCCTGGAACTCACTH-2D区d型探针序列如下:23bpAGACCAGGCTGGCCTTGACTCAG1.3.3pbs-tween20的制备取基因组DNA各10μL于100℃水浴中加热变性5min立即放入冰盒,置于-20℃低温冰箱5min;在酶标板的微孔内分别加入变性的DNA10μL,再加入固定液至100μL,37℃恒温孵箱孵育2h;PBS-Tween20漂洗2次,每次2min;加入100μL杂交液,1.0μL探针,使探针的终浓度为500ng/mL;封口,68℃水浴摇床轻摇20min;倒掉反应液,用2×SSC于68℃漂洗2次,每次2min;用1×SSC于37℃漂洗2次,每次2min;用0.2×SSC于室温漂洗2次,每次2min;加入1∶200亲和素标记的辣根过氧化物酶(10%小牛血清用PBSpH7.4配制)100μL于37℃恒温孵箱孵育1h;PBS-Tween20漂洗5次,每次3min;加入显色液100μL,避光显色15min;加入50μL终止液(2mol/mLH2SO4);酶标仪检测结果。2结果2.1待检dna与探针反应孔a值参照实验动物病毒抗体ELISA诊断标准①待检DNA与特异探针反应孔的A值阴性DNA对照与特异探针反应孔的A值≥2.1;②待检DNA与特异探针反应孔的A值≥0.2;③待检DNA与探针对照反应孔和待检DNA与特异探针反应孔应有明显的颜色区别,符合以上三个条件,判为阳性。2.2lisa检测结果根据酶标仪检测的结果可知H-2b型近交系小鼠C57BL/6和C57BL/10与探针b发生了特异反应,数据符合上述标准,因此可以确定这两种近交系小鼠的H-2基因型为b型;DBA/2、BALB/c和Scid与探针d发生了特异反应,所以这三种近交系小鼠的H-2基因型为d型;C3H和615与k型探针发生了特异反应,因此这两种近交系小鼠的H-2基因型为k型。国内品系NCPC/2、TA1、TA2和T739均和b型探针发生了特异反应,因此可确定这几种近交系的H-2基因型为b型。检测结果见表1。表1是酶标仪检测结果的具体数据,根据表中的数据按照上述标准进行计算,进行各种近交系小鼠品系的推断。参照实验动物病毒抗体ELISA诊断标准根据表中原始数据进行计算如下:其中Ab代表该品系与b型探针反应后的A值,Ad代表该品系与d型探针反应后的A值,Ak代表该品系与k型探针反应后的A值。根据公式2.1①计算所得的结果如表2显示,文中所有近交系动物的计算结果均符合本公式的标准,同时待检DNA与特异探针反应孔的A值均≥0.2,且均有明显的颜色区别。所以根据上述标准可以判定个品系的H-2基因型。3pcr和资料处理的h-2基因型的确定近交系小鼠遗传质量检测,从形态学、细胞学水平已发展到了分子生物学水平。形态学、细胞生物学水平的检测方法虽各具优点,使用广泛,但都是观察基因的表现型,没有从基因本质上或从基因产物的结构上做观测分析,有一定的局限性,甚至必须几种方法联合观测,才能对品系的遗传关系和纯度做出正确判断,这就需要耗费许多时间、人力、物力。而分子生物学水平的检测方法,可直接测出基因的变化,即可测出DNA的变化,结果更为直接、准确。根据需要设计了针对H-2D区的b、d、k三种类型探针,对较常用的近交系品系进行了检测,其中从国外引进的品系:C57BL/10、C57BL/6小鼠H-2基因型为b型,DBA/2、Scid小鼠H-2基因型为d型,C3H、615小鼠H-2基因型为k型,而国内自己培育的品系:TA1、TA2、T739、NCPC/2小鼠的基因型目前国内外均未见报道,但根据我们设计的PCR实验结果和Southern杂交结果显示这些品系均为b型。因此通过PCR实验和Southern杂交实验即可确定近交系小鼠的H-2基因型。此结果与微量细胞毒方法和PCR方法检测的结果一致。我们采用微孔板Southern杂交,与传统的膜杂交相比具有快速、灵敏、方便等优点。传统的膜杂交耗时十几天,并且反应程序复杂,杂交条件苛刻,需要配制大量的试剂,其中有些试剂昂贵,有些试剂对人体具有毒性,如果使用放射性标记的探针还会对人体有远期的伤害。而本实验中使用生物素标记,对人体是无害的。Southern杂交中设计的探针长度为35bp左右,这样可消除非特异性结合;而PCR受温度、DNA聚合酶、pH等因素的影响,往往出现非特异性扩增产物。Southern杂交是以整个靶DNA链的序列同源性作为基础,并且随着杂交温度、漂洗严格程度的提高,可消除非特异性结合。另外Southern杂交后的结果通过酶标仪读数,结果更客观、准确,消除了人为因素造成的假阳性或假阴性。经典的Southern杂交方法被广泛应用于遗传学领域,以其灵敏性和特异性而成为检测技术的尖端,我们针对经典Southern杂交程序复杂,反应时间长等缺点进行了改进,采用微孔板Southern杂交,既