微卫星dna标记的应用

微卫星dna标记的应用

微卫星dna标记是经过rill技术开发的下一代分子遗传标记技术。微卫星DNA的PCR产物检测方法主要有同位素标记引物的聚丙烯酰胺电泳法、荧光标记引物的测序法以及聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法等。自20世纪80年代以来,经过二三十年的不断发展,微卫星DNA标记技术因其数量大、分布广且均匀、多态性丰富、呈孟德尔共显性遗传、检测快速方便以及结果稳定可靠等优点,已被广泛应用于各个领域。1简单重复序列和分子标记的发展1974年,Skinner等在研究寄居蟹的基因组时发现了微卫星DNA的重复序列。此后,在人、动物和酵母的基因组中都发现了类似大量的简单重复序列。直到1986年,Ail等首次用合成的微卫星寡核苷酸作为探针用于人的指纹分析,这时才得到重视。1988年,Jeffreys等人做了进一步的研究并使之发展成为新的遗传分子标记系统。1989年,Litt等[1扩增到了人类基因组微卫星序列,从而创造了“微卫星(microsatellite)”这个名称。2ts与str微卫星DNA又称简单重复序列(simplesequencerepeats,SSR)或短串联重复序列(shorttandemrepeats,STR),是指以少数几个核苷酸(一般是1~6个)为单位串联重复的DNA序列。这些重复序列的重复次数和重复程度在不同的生物体内高度变化,并且随机分布于真核生物基因组中。普遍认为,在染色体上,除着丝粒及端粒区域外,其他区域也广泛散在分布有微卫星位点。Weber根据微卫星核心序列排列方式的不同,将其分为完全(无间隔)、不完全(有非重复单位的碱基间隔)和复合型(2个或更多重复单位彼此毗邻连续出现)微卫星3种类型。3私卫星dna标记的优点3.1微卫星标记的特点(1)分布广泛。微卫星DNA广泛且均匀地分布于真核生物基因组中。(2)多态性丰富。由于微卫星在不同个体中的重复单位数目变异大,因而造成其长度具有高度的多态性,使其可以包含大量丰富的信息。(3)简易高效安全性。微卫星检测方法简便且效率高,单个位点检测时间很短,一般不超过24h,并可以多个位点同时进行检测。微卫星标记没有任何表型效应,因而不存在对家畜个体的有害或次级效应。(4)保守与通用性。微卫星侧翼序列的保守性以及物种间某些染色体区段的共线性,某一物种的微卫星引物可以应用于相近物种。(5)共显性遗传。微卫星标记的等位基因遵循孟德尔共显性遗传,因而易区分纯合型和杂合型。3.2缺点(1)建立和筛选基因文库,进行克隆和测序,都是非常繁琐、耗时的工作。(2)由于不同物种的微卫星侧翼序列不尽相同,因此针对不同物种设计相应的特异性引物也非常耗时。(3)微卫星进化具有复杂性,可能出现同源异型或异源同型。(4)PCR扩增受许多因素的影响,使一些等位基因无法被扩增出来,即“无效基因”。影响亲子鉴定的正确性。(5)目前还没有发现哪个DNA探针能很好地匹配他们各自的多态性。4私卫星dna标记的应用4.1微卫星位点和标记的定位与构建微卫星DNA既可作为探针用于杂交分析,又可以根据其后序列设计引物,进行PCR扩增、检测。因而,构建遗传图谱非常有效。以微卫星位点为基础在基因组中每隔一定距离找一个多态的微卫星标记,当这些标记达到一定的饱和度,也就构建出了遗传连锁图。随着使用微卫星标记制作基因图谱的标记数量的增加,饱和度日趋增大,平均距离逐步缩小,遗传图谱的精确度随之提高。4.2微卫星标记法近年来,遗传图谱的进展主要是依赖于分子遗传学标记,特别是微卫星DNA标记的不断发现,利用微卫星与功能基因和QTL间的连锁关系,使遗传图谱上定位的功能基因和QTL不断增加。Ashwell等通过微卫星位点将一个控制奶牛体细胞评分的QTL定位于牛的23号染色体上,将牛的双肌基因MH定位于牛的2号染色体上,与微卫星标记TGLA-44相连锁。Georges等首次在美国核心奶牛群中用159个微卫星位点进行基因组分析,在第1,6,9,10和20号染色体上发现了对产奶性状有影响的QTL。另外,畜禽的大多数重要经济性状表型值受许多基因与环境因子共同作用,在实际生产中难以选择确定,利用微卫星标记与某些功能基因或QTL的连锁关系,可对功能基因在染色体上的位置及其效应进行确定和跟踪,计算出单个QTL产生的效应值,有效提高品种选育的选择效率,大大提高了人们对数量性状优良基因型选择的准确性和预见性。Forster等使用单标记退化、单内部图谱和复合内部图谱方法,对多年生黑麦草进行了QTL分析,在5个不同的样本中观察到42个QTL,在连锁群3,5,7中观察到相似的QTL;LG3区域与所有可测量性状相联系;LG7区域除CP外,和所有性状变化相联系。4.3排除有利基因利用微卫星进行标记辅助选择具有很大潜力,它改变了从表型值推断基因型值的选择过程,还可以在育种早期排除那些非必需染色体区段,有目的的导入有利基因,剔除不利基因。增大选择强度,定向培育新品种、品系或品系群,缩短世代间隔,提高群体性能,从而大大减短育种年限和降低选育成本。4.4基因型与知识产权法相结合的调节利用微卫星DNA多态性及高突变率测定群体间的遗传相关性,可以计算遗传距离和遗传纯度,准确度量群体遗传变异,测定选育个体的基因型与估计个体的表型和育种值,这与传统杂交组合试验相比,减少了繁重的测定工作,节省育种时间与费用,从而开展精确选育。有研究发现,用DNA多态性测定品种间或品系间的差异,并据此作出遗传距离要比其他材料稳定。孙少华等利用微卫星标记技术分析了肉牛杂交亲本群体的遗传结构和遗传变异,预测了最优杂交组合并在此基础上对18个肉牛杂交组合的实际杂交效果利用个体模型进行了评估。4.5微卫星方法进行遗传鉴定在育种实践过程中,随着对动物个体及其产品要求的提高,准确的系谱记录是非常必要的。由于微卫星DNA具有高度的个体专一性和多态性,已逐步代替了早期使用的血型、血液蛋白等多态性低的指标。用微卫星方法来鉴定畜禽的亲缘关系,就是利用微卫星位点的多态性,以多个位点在一定群体中各等位基因的频率为基础来进行血缘鉴定和血缘控制。张亚平等利用微卫星DNA标记成功地对大熊猫进行了亲子鉴定。张于光等利用微卫星DNA标记成功地鉴定了7个父子关系不明的东北虎。4.6小鼠群体遗传多样性检测试验动物近交系与普通试验动物相比,由于其基因高度纯合,遗传背景清楚而具有极大的优越性。由于微卫星DNA标记有数量多、重复性好、可比性强以及共显性等特点,因而被用于近交系动物的基因纯合度检测及遗传监测等,可有效地检测其遗传质量以及其近交程度。谢建云等利用微卫星DNA标记检测了来源于2个单位的近交系BALB/c小鼠和封闭群ICR小鼠,并根据检测结果作了遗传分析。结果表明,A单位BALB/c小鼠发生了遗传污染,有部分小鼠在部分微卫星位点发生了变异,而B单位BALB/c小鼠在所有的检测位点上的结果都与预期的BALB/c小鼠位点一致;对ICR小鼠分析结果发现,A单位ICR小鼠在22个位点的平均杂合度为0.379,平均多态信息量为0.308,属中度多态,B单位ICR小鼠的平均杂合度为0.287,平均多态信息量为0.227,属低度多态。李凯等利用14对微卫星DNA标记检测了五指山小型猪F13-F18世代的3个近交家系。结果表明,在14个微卫星基因座上共检测到38个等位基因,群体平均基因杂合度仍高达0.42,平均信息含量处于相当高的水平,这非常客观地反映了“五指山猪”的近交程度并没有达到培育者所宣称的那样高。牛荣等利用35个微卫星DNA标记对版纳微型猪近交系5个家系进行了遗传检测,发现版纳微型猪近交系5个家系均具有很高的近交水平,其多态性信息含量都非常低,且各家系均已构成独立的遗传群体。4.7期生养品的遗传稳定性研究生物个体或群体间表现出来的各种遗传变异,在本质上就是DNA的差异,因此通过研究DNA的变异来分析遗传多样性及群体的遗传结构比其他方法都更为直接和准确。牛荣等利用35个微卫星DNA标记对贵州小型猪、广西巴马小型猪的封闭群进行了遗传检测,发现这两个品系均有稳定的遗传,且二者的亲缘关系较近。孙少华用6个微卫星位点分析8个肉牛杂交亲本群体的遗传变异。Krishna用18个荧光标记微卫星DNA引物对48个瓦伦西亚花生品种进行了研究,扩增出了120个多态性位点,平均每个引物6.9个等位基因,经数据分析发现,瓦伦西亚花生有相当大的遗传多态性。而根据已建立的基因图谱,利用微卫星DNA多态性可以反映物种的进化历史,还可以在DNA水平上更精确地分析物种的进化速度、遗传距离以及由此推断系统的进化与演变,用微卫星标记技术绘制的系统发生树要比其他分子遗传学标记更为精确和高效。Buchanan等用微卫星标记研究了5个不同羊品种间的遗传距离与进化关系。Estoup等采用7个微卫星DNA标记对9群西方蜜蜂,进行分析,证明西方蜜蜂由3个亲缘较远的血统进化而来。4.8注重遗传多样性评估和遗传稳定性生物物种的灭绝,也就意味着该物种所携带的遗传物质将随之消失,导致遗传多样性下降。因此,遗传多样性水平的度量和保护已成为生物多样性研究的主要内容。通过微卫星DNA标记对遗传多样性的评估,可检测个体基因型,统计群体中的微卫星位点等位基因的数目和频率,了解物种的遗传结构和生活背景,分析其进化的历史。结合分子遗传学和数量遗传学原理,计算各个品种的遗传变异关系。对目标基因在保种群世代传递过程中的分离和重组进行跟踪,通过有意识地选留,防止目标基因由于遗传漂变而丢失,并探讨品种濒危的原因,提出合理的保种措施。张亚平等用微卫星DNA进行圈养大熊猫的亲子鉴定,发现在一雌多雄交配过程中,只对个别雄性是有效的。该研究还进一步结合微卫星DNA的鉴定结果,制定了繁殖计划,以防止近交衰退。4.9人类疾病的诊断和移植(1)法医科学。微卫星DNA在法医科学中一般称为短串联重复,已被应用于法医鉴定中,比较经典的就是先寻找并获取与犯罪嫌疑人有关的皮肤、血液、精液、头发等残留组织,从中提取DNA,利用微卫星的基因图谱与疑犯的微卫星档案对比来判断真正的罪犯。(2)人类疾病的诊断研究。近年来发现,基因内外的一些微卫星DNA重复序列与遗传病的发病有关。例如与三核苷酸重复片段扩增突变有关的脊髓延髓肌肉萎缩(SBMA)、强制性肌营养不良(DM)等。由于造血干细胞移植手术的成功与否,主要取决于植入的干细胞能否在受体体内顺利生长。微卫星DNA也已被广泛应用于造血干细胞的移植检测。吕德坚等的研究表明,使用复合扩增多个微卫星技术来监测脐血移植,在没有受体移植前或供体的对照样本时,也可以检验。微卫星不稳定性MSI(microsatelliteinstability),是由于DNA复制错误引起的简单重复序列的增加或丢失的情况下又没得到DNA错配修复系统的修复而产生的。MSI首先在结肠癌和直肠癌中发现,后来随着深入研究,MSI在肺癌、胃癌、白血病等其他肿瘤中也相继发