热休克蛋白60和热休克蛋白70在口腔扁平苔藓病变中的表达

热休克蛋白60和热休克蛋白70在口腔扁平苔藓病变中的表达

扁平苔藓（pmi）是一种常见的皮肤粘膜疾病。虽然近年研究表明T细胞介导的免疫反应对LP的发病起了重要作用,但其发病机制仍不明确。热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)又称应激蛋白(stressprotein,SP),是一类非常保守的蛋白质分子家族,自从20世纪80年代确定HSP的序列和基因结构位点以来,很多研究发现,HSP在细胞保护、免疫应答、信号转导及调节凋亡等方面具有重要作用,并且发现HSP参与某些疾病的发病过程。但是,对HSP在口腔LP(oralLP,OLP)中的表达和作用的研究较少,为此,我们探讨了HSP60及HSP70在OLP病变中的作用。数据和方法1.hsp60的免疫组织化学选取北京大学口腔医学院病理科1998～2001年存档的OLP标本62例(其中糜烂型14例、非糜烂型48例),慢性盘状红斑狼疮21例,粘膜良性淋巴组织增生病10例,白斑10例进行HSP60的免疫组织化学研究。HSP70研究所用白斑标本为46例(单纯增生12例,轻度异常增生13例,中度异常增生11例,重度异常增生10例)。标本均经10%甲醛固定、常规石蜡包埋。用于RT-PCR的组织为取自典型OLP病损区的新鲜组织,沿组织长径中线分切标本,一半组织用于HE染色确诊,一半迅速置-70℃冰箱冻存。正常粘膜5例,-70℃冻存。标本经组织学证实为典型的OLP,且均是未经激光、激素、免疫调节治疗,不伴其他口腔感染性疾患的原发病例。正常粘膜取自健康人口腔粘膜。2.小鼠igg、过氧化物酶链亲和素及免疫基化微波处理行抗原修复。试剂:鼠抗人HSP60单克隆抗体为迈新公司产品;生物素化马抗小鼠IgG、过氧化物酶链亲和素购自中山公司。结果判定:以胞核或胞质中出现棕黄色颗粒为阳性。阳性对照片明显着色,阴性对照无着色。染色强度分为两个级别:胞核或胞质中出现浅棕黄色颗粒为弱阳性;出现深棕黄色颗粒为强阳性。3.pcr扩增周期引物:HSP60(扩增产物为190bp)上游引物:5′ATGTTATCGAGATTGTGTGGGAA3′,下游引物:5′TACGCAATGCACGATTACTG3′。HSP70(扩增产物为550bp)上游引物:5′AATAATAGTAAAGATCACAAAGT3′,下游引物:5′TAATTTCATTAACTTCAACTTCACT3,均以β-actin(扩增产物为300bp)作为内对照,其上游引物:5′CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3′,下游引物:5′ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3′。PCR循环25个周期。其产物经2%琼脂糖凝胶电泳,采用GelPro3.0灰度分析软件分析结果,得到目的基因与β-actin的灰度值及二者的比值。4.统计评估用SAS软件精确概率法和t检验对结果进行统计学分析。结果一、hsp60表达1.正常口腔粘膜上皮细胞和结缔组织为阴性。2.OLP病损区的阳性表达见于上皮基底细胞、棘层细胞的胞质内。固有层浸润的淋巴细胞可见弱阳性表达。3.慢性盘状红斑狼疮、粘膜良性淋巴组织增生病、白斑以阴性表达为主,弱阳性表达偶见于上皮基底细胞、棘层细胞的胞质内。4.统计学结果:①LP与其他各组相比,HSP60阳性率和染色强度的差异有显著性,P<0.001。②糜烂型LP和非糜烂型LP之间阳性率和染色强度间差异无显著性,P>0.05。非扁平苔藓的各组之间差异无显著性。二、hfs70免疫组的染色特征表2和表31.正常粘膜上皮基底细胞的胞核和胞质呈弱阳性表达,染色均匀。2.胶质细胞的染色HSP70阳性表达见于上皮基底细胞、棘层细胞的细胞核及胞质内,上皮层着色方式有两种:连续着色、灶性着色。固有层内淋巴细胞、血管内皮细胞有阳性着色。3.染色强度不一致阳性表达见于上皮基底细胞、棘层细胞,着色强度不一致。单纯增生和轻度异常增生可见淋巴细胞阳性表达,中-重度异常增生淋巴细胞染色强度下降。4.粘膜良性淋巴结组织增生阳性表达偶见于上皮基底细胞。5.慢性狼型个别病例的上皮细胞呈弱阳性表达。6.输注后淋巴hsp80表达①糜烂型LP上皮细胞、淋巴细胞染色阳性率和染色强度下调,与非糜烂型相比差异有显著性,P<0.001。②粘膜良性淋巴组织增生病、慢性盘状红斑狼疮的HSP70以阴性表达为主,均与非糜烂型LP间差异有显著性,P<0.001。③白斑各组上皮细胞染色强度不均一,与糜烂型LP间差异有显著性。④白斑各组淋巴细胞HSP70表达阳性率与非糜烂型LP相比差异有显著性。淋巴细胞染色强度在重度异常增生时减弱,与糜烂型和非糜烂型LP相比差异均有显著性,P<0.001。三、mrna/-actin水平的分析OLP(12例)和正常粘膜(5例)HSP60mRNA/β-actin水平的灰度比值分别为0.75±0.026、0.86±0.062,两组相比差异有显著性,P<0.001。四、mrna/-actin水平的分析OLP(12例)和正常粘膜(5例)HSP70mRNA/β-actin水平的灰度比值分别为0.674±0.027、0.80±0.063,两组相比差异有显著性,P<0.001。hsp60在病理变化和病理生理中的表达HSP是生物界广泛存在的高度保守的蛋白质家族,具有致病和保护、预防双重性质。近年来有研究表明HSP参与某些疾病的发生,尤其是HSP60和HSP70家族。本研究结果显示,OLP的HSP60表达的阳性率、染色强度与正常粘膜、慢性盘状红斑狼疮、粘膜良性淋巴组织增生病相比差异存在显著性(P<0.001)。HSP60在OLP病损区表达以上皮层细胞强阳性表达为主,固有层浸润的淋巴细胞有弱阳性表达、血管为阴性。基底膜不清晰,基底细胞液化严重的区域染色强度下降。这些结果与Chaiyarit的发现有一定的一致性。免疫组化结果提示,HSP60在OLP中的表达存在较为特异的一面,有不可忽视的作用。一些研究发现OLP与细菌病毒感染有关,而LP病损区上皮基底细胞、棘层细胞的HSP60强阳性表达说明该病存在明显的应激因素,这种应激因素有可能来自细菌或病毒感染或其他刺激。Sugerman等提取OLP患者病损区的淋巴细胞,用HSP60刺激培养的淋巴细胞,发现了淋巴细胞的增殖。可能由于HSP的高度保守性,人体T细胞在识别、攻击外来抗原的同时将过度表达HSP60的上皮角质形成细胞也作为靶细胞,造成上皮基底细胞的破坏。因此,HSP60在病损区上皮细胞的强阳性表达可能是病变过程中的一个重要事件,提示OLP具有自身免疫性疾病的特点。HSP70是HSP家族中行使保护功能的主力军,它在OLP上皮层可连续着色或灶性着色。上皮可以表现为全层连续着色,以基底细胞、棘层细胞为主,基底细胞通常可见细胞核的阳性表达。固有层浸润的淋巴细胞、血管内皮细胞也呈现阳性表达。有研究表明,在应激状态下,HSP70会在细胞核高表达,起保护作用。外来刺激,如细菌、病毒感染,不良理化刺激都有上调HSP的可能。LP固有层结缔组织浸润的淋巴细胞的HSP70阳性表达说明了浸润之淋巴细胞处于一种特殊的状态,是否淋巴细胞过度表达HSP70而失去了正常的凋亡程序,使其过度发挥作用而加重致病作用,尚需进一步研究。HSP70的表达上调还发生在LP淋巴细胞浸润密集的周围区域。本研究中这些区域上皮基底细胞HSP70的表达强度较正常粘膜升高,这可能是由于淋巴细胞的活化和浸润产生了大量的细胞因子,刺激了这些区域的上皮细胞。白斑病变中,上皮细胞染色阳性率随异常增生程度的增加而降低,中度异常增生和重度异常增生的病例固有层的炎症细胞HSP70为阴性。这从另一个角度说明了OLP和白斑的发病过程有本质差别。而白斑单纯增生和轻度异常增生的病例中淋巴细胞有HSP70的阳性表达,提示在上皮细胞发生改变的早期可能存在与刺激和炎症反应有关的某个过程。HSP70主要体现着机体对刺激的反应和保护机制,其表达方式和特点有很多不同之处。正常粘膜HSP70的弱阳性表达说明了正常口腔粘膜也有轻度刺激因素存在,HSP70的弱阳性表达起到了恰当的保护作用。糜烂型LP的HSP70下调说明糜烂型LP的细胞保护机制受损,缺乏必要的细胞保护作用。粘膜表面糜烂,失去了保护屏障,使组织接受到的刺激强度增大,可能由于长期反复的刺激使细胞耐受刺激的域值升高或其他复杂的机制,使HSP70阳性表达反而降低。而细胞保护机制的降低又会加重病情。糜烂型LP病情迁延波动可能与缺乏恰当的细胞保护机制有关。HSP70的表达特点说明其在应激和疾病发生中起着双重作用,可能主要体现着分子保护机制。HSP基因的表达、转录、