第三章 微生物的生长及其控制

第三章微生物的生长及生长条件第一节微生物生长及测定第二节微生物群体的生长规律第三节微生物的生长条件及其控制第一节微生物生长1微生物生长的概念微生物在适宜的外界环境条件下，不断地吸收营养物质，并按自身的代谢方式进行新陈代谢，如同化作用大于异化作用，其结果是原生质的总量（包括重量、体积、大小）不断地增加，称为微生物的生长现象。生长定义为微生物细胞在群体水平上增加，也可以认为是微生物群体数量增加。许多微生物是以二分裂的方式生长的。一般细胞分裂和染色体复制是协调控制的。单细胞微生物如细菌的生长，往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程度时，就以二分裂方式，形成两个相似的子细胞，子细胞又重复上述过程，使细胞数目增加，称为繁殖。在多细胞微生物中，例如某些霉菌，细胞数目的增加如不伴随着个体数目的增加，只能叫生长，不能叫繁殖。例如菌丝细胞的不断延长或分裂产生同类细胞均属生长，只有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫做繁殖。第二节微生物群体生长的规律微生物的群体生长规律单细胞的微生物，如细菌、放线菌在液体培养基中，可以均匀地分布，每个细胞接触的环境条件相同，都有充分的营养物质，故每个细胞都迅速地生长繁殖。霉菌多数是多细胞微生物，菌体呈丝状，在液体培养基中生长繁殖的情况与单细胞微生物不一样，如果采取摇床培养，则霉菌在液体培养中的生长繁殖情况，近似于单细胞微生物。因液体被搅动，菌丝处于分布比较均匀的状态，而且菌丝在生长繁殖过程中不会像在固体培养基上那样有分化现象，孢子产生也较少。（1）典型的生长曲线微生物生长繁殖的速度非常快，一般细菌在适宜的条件下，大约20~30分钟就可以分裂一次，如果不断迅速地分裂，短时间内可达惊人的数目，但实际上是不可能的。

在培养条件保持稳定的状况下，定时取样测定培养液中微生物的菌体数目，发现在培养的开始阶段，菌体数目并不增加，一定时间后，菌体数目就增长很快，继而菌体数目增长速度保持稳定，最后增长速度逐渐下降以致等于零。如果以培养时间为横坐标，以单细胞增长数目的对数值作纵坐标，就可作出一条生长曲线。这生长曲线（growthcurve）代表单细胞微生物从生长开始到衰老死亡的一般规律。根据微生物的生长速率常数（growthrateconstant），即每小时的分裂代数的不同，一般把典型的生长曲线粗分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。

（一）

延滞期（lagphase）又叫适应期、缓慢期或调整期，是指把少量微生物接种到新培养液刚开始的一段时间细胞数目不增加的时期，甚至细胞数目还可能减少。延滞期有如下特点：（1）生长的速率常数为零。（2）细胞的体积增大，DNA、含量增多为分裂做准备。（3）合成代谢旺盛，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。（4）对不良环境敏感，例如pH、NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学物质。

为了提高生产效率，发酵工业中常常要采取措施缩短延滞期，具有十分重要的意义，其方法主要有：（1）以对数期的菌体作种子菌，（2）适当增大接种量，生产上接种量的多少是影响延滞期的一个重要因素

，接种量大，延滞期短，接种量小，则延滞期长。一般采用3~8%的接种量，最高不超过1/10。（3）培养基的成分

为了缩短培养基的营养成分差异，常常在种子培养基中加入生产培养基的某些营养成分，即是种子培养基尽量接近发酵培养基。（二）对数期（logarithmicphase）又叫指数期，指在生长曲线中，紧接着延滞期后的一段时期。此时菌体细胞生长的速率常数R最大，分裂快，细胞每分裂繁殖一次的增代时间（即代时，generationtime）短，细胞进行平衡生长，菌体内酶系活跃，代谢旺盛，菌体数目以几何级数增加，细胞以惊人的速度产生，群体的形态与生理特征最一致，抗不良环境的能力强。图3-12生长曲线中的指数期

(三)稳定期

（stationaryphase）在分批培养中，指数生长不可能无限制地存在。可以计数一下，一个单细胞细菌代时为20分钟，如果以指数生长连续生长48小时，则生成的群体细胞重量约是地球的许多倍。这种现象给人印象格外深刻，因为一个单细胞重量约为1×10－12g。显然，在指数生长延长到48小时之前，一定有一些物质限制了群体细胞生长，因此进入稳定期。稳定期又叫最高生长期或恒定期。处于稳定期的微生物其特点是新繁殖的细胞数与衰亡细胞数几乎相等，细胞数目没有净增加或净减少，即是正生长与负生长达动态平衡，此时生长速度逐渐趋向于零。出现稳定期的原因主要有：（1）营养物质特别是生长限制因子的耗尽，营养物质的比例失调，例如C/N比值不合适等；（2）酸、醇、毒素或过氧化氢等有害代谢产物的累积；（3）pH、氧化还原势等环境条件越来越不适宜等。在稳定期虽然没有出现生长，但许多细胞功能包括能量代谢和某些生化合成过程都仍然在继续，稳定期的微生物，在数量上达到了最高水平，产物的积累也达到了高峰，这时，菌体的总产量与所消耗的营养物质之间存在着一定关系。此外，由于对稳定期到来的原因进行研究，促进了连续培养技术的产生和研究。生产上常常通过补料、调节温度和pH等措施，延长稳定期，以积累更多的代谢产物。

（四）衰亡期（declinephase或

deathphase）如果群体细胞达到稳定期后仍继续培养，这些细胞或许仍能维持生命和继续进行代谢，但它们也可能死亡。如果出现死亡，就认为群体细胞处于衰亡期。稳定期后，微生物死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”（R为负值），此阶段叫衰亡期。这时，细胞形态多样，例如产生很多膨大、不规则的退化形态；有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应为阳性的变成阴性；有的微生物因蛋白水解酶活力的增强发生自溶（autolysis）；有的微生物在这时产生抗生素等次生代谢产物；对于芽孢杆菌，芽孢释放往往也发生在这一时期。衰亡期微生物形态发生变化酵母菌和霉菌的生长曲线酵母菌的生长曲线：与单细胞微生物基本相似。丝状真菌的生长曲线：在液体或深层培养中，以菌丝干重作为衡量的指标，菌丝的生长过程分为3个阶段：生长停滞期、迅速生长期、衰亡期，6个时期，即停滞期、指数期、线性期、减速期、稳定期、衰亡期。微生物的连续培养与分批培养分批培养：菌体培养后，一次性收获菌体或代谢产物的培养方法。我们讨论群体生长，在固定体积培养基中出现的微生物生长会连续不断地被生长的微生物体活动所改变，直到培养基不再适合它的生长。在分批培养的指数前期，培养条件或许可以维持相对稳定，但在后期，当细胞数目变得非常大的时候，培养基的化学组成一般会发生巨大的变化。对许多研究来说，都希望能长时间地保持培养物处于一种稳定的环境中，这就可以通过使用连续培养而获得。连续培养(continuousculture)又叫开放培养(openculture)，是相对分批培养(batchculture)或密闭培养(closedculture)而言的。连续培养是在研究典型生长曲线的基础上，认识到了稳定期到来的原因，采取在培养器中不断补充新鲜营养物质，另一方面，及时不断地以同样速度排出培养物（包括菌体和代谢产物）。这样，培养物就可达动态平衡，其中的微生物可长期保持在对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率上。连续培养不仅可随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验材料，而且可提高发酵工业的生产效益和自动化水平，此法已成为目前发酵工业的发展方向。第三节微生物的生长条件及其控制影响微生物生长的外界因素很多，其一是前面讨论过的营养物质，其二是许多物理、化学因素。当环境条件的改变，在一定限度内，可引起微生物形态、生理、生长、繁殖等特征的改变；当环境条件的变化超过一定极限时，则导致微生物的死亡。研究环境条件与微生物之间的相互关系，有助于了解微生物在自然界的分布与作用，也可指导人们在食品加工中有效地控制微生物的生命活动，保证食品的安全性，延长食品的货架期。无论是在自然界中，生物体之间存在相互作用，还是在实验室中纯培养的微生物之间的相互作用，环境因素都能在很大程度上影响它们的生长和代谢产物的能力，这里重点讨论其中最主要的温度、pH、水的有效利用率和氧气等几大因素。

生长繁殖，积累发酵产物环境微生物生长抑制、变异、死亡食品质量控制消毒——是指杀死或消除所有病原微生物的措施，可达到防止传染病传播。防腐——指利用某些理化因子，使物体内外的微生物暂时处于不生长繁殖但又未死亡的方法。常用低温、干燥、盐腌、糖渍等方法，或加化学防腐剂于食品中防止食品腐败、变质。灭菌——是指利用一切物理或化学因子，使存在于物体内所有活的微生物，永久性地丧失其生活力，包括最耐热的细菌芽孢，是一种彻底杀菌措施。商业灭菌——又叫杀菌，是从商品的需要出发对食品进行的灭菌，它是指食品经过杀菌处理后按照一定的检验方法检不出活的微生物或仅能检出极少数非病原微生物，而且它们在一定的保存期内不致引起食品变质腐败。死亡——对事物来说是不可逆的丧失了生长繁殖能力。

物理因素对微生物生长的影响一、温度温度是影响微生物生长繁殖最重要的因素之一。在一定温度范围内，机体的代谢活动与生长繁殖随着温度的上升而增加，当温度上升到一定程度，开始对机体产生不利的影响，如再继续升高，则细胞功能急剧下降以至死亡。与其他生物一样，任何微生物的生长温度尽管有高有低，但总有最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度这三个重要指标，这就是生长温度的三个基本点。如果将微生物作为一个整体来看，它的温度三基点是极其宽的，由以下可看出：

最低生长温度（一般为–5~–10℃，极端为–30℃）

嗜冷菌

(15~20℃)生长温度三基点最适生长温度

嗜中温菌

(20~45℃)

嗜热菌

(45~65℃)

最高生长温度（一般为80~95℃，极端为105~300℃）

就总体而言，微生物生长的温度范围较广，已知的微生物在零下12~100℃均可生长。而每一种微生物只能在一定的温度范围内生长。当环境温度超过微生物生长的最高温度、或环境温度低于微生物生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用图4-17温度对典型的嗜冷生物、嗜温生物、嗜热生物及两种不同的嗜高温生物的生长速率之间的关系最低生长温度

:是指微生物能进行繁殖的最低温度界限。

最适生长温度:

是指某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。但是，同一微生物，不同的生理生化过程有着不同的最适温度，也就是说，最适生长温度并不等于生长量最高时的培养温度，也不等于发酵速度最高时的培养温度或累积代谢产物量最高时的培养温度，更不等于累积某一代谢产物量最高时的培养温度。因此，生产上要根据微生物不同生理代谢过程温度的特点，采用分段式变温培养或发酵。例如，嗜热链球菌的最适生长温度为37℃，最适发酵温度为47℃，累积产物的最适温度为37℃。最高生长温度:

是指微生物生长繁殖的最高温度界限。在此温度下，微生物细胞易于衰老和死亡。微生物所能适应的最高生长温度与其细胞内酶的性质有关。例如细胞色素氧化酶以及各种脱氢酶的最低破坏温度常与该菌的最高生长温度有关。

致死温度:

最高生长温度如进一步升高，便可杀死微生物。这种致死微生物的最低温度界限即为致死温度。在一定的温度下处理时间越长，死亡率越高。严格地说，一般应以10分钟为标准时间。细菌在10分钟被完全杀死的最低温度称为致死温度。

（一）低温型的微生物

又称嗜冷微生物，可在较低的温度下生长。地球表面温度大多数相当低，海洋覆盖了地球表面的一多半，平均温度为5℃，开放海洋的深处，恒定温度在1～3℃。常见的产碱杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、微球菌属等常使冷藏食品腐败变质。有些肉类上的霉菌在零下10℃仍能生长，如芽枝霉；荧光极毛菌可在零下4℃生长，并造成冷冻食品变质腐败。对于嗜冷微生物研究要非常小心，这些嗜冷性微生物如果处于室温下很短一段时间可能就会被杀死。因此，在采样、运输以及实验室接种、涂布平板等操作过程中防止温度升高。耐冷微生物比嗜冷微生物分布广泛得多。可以从温带环境的土壤、水中、肉类、奶类制品及储藏在冰箱中的苹果汁、蔬菜中分离到。耐冷性的微生物在20～40℃之间能很好地生长。（二）中温型的微生物

绝大多数微生物属于这一类。最适生长温度在20—40℃之间，最低生长温度10—20℃，最高生长温度45—65℃。它们又可分为嗜室温和嗜体温性微生物。嗜体温性微生物多为人及温血动物的病原菌，它们生长的极限温度范围在10—45℃，最适生长温度与其宿主体温相近，在35—40℃之间，人体寄生菌为37℃左右。引起人和动物疾病的病原微生物、发酵工业应用的微生物菌种以及导致食品原料和成品腐败变质的微生物，都属于这一类群的微生物。因此，它与食品工业的关系密切。(三)高温型微生物

它们适于在45—50℃以上的温度中生长，在自然界中的分布仅局限于某些地区，如温泉、日照充足的土壤表层、堆肥、发酵饲料等腐烂有机物中，如堆肥中温度可达60—70℃。能在55—70℃中生长的微生物有芽孢杆菌属（Bacillus）、梭状芽孢杆菌（Clostridium）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bac.stearothermophilus）高温放线菌属（Thermoactinomyces）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）等；温泉中的细菌；其次是链球菌属和乳杆菌属。有的可在近于100℃的高温中生长。这类高温型的微生物，给罐头工业、发酵工业等带来了一定难度。许多热泉温度接近沸点，蒸汽口（热泉喷气孔）温度可达150～500℃。海洋底部热水口温度约达350℃或更高，但主要集中在美国西部、新西兰、冰岛、日本、地中海地区、印度尼西亚和法国等地区。世界上具有最大的热泉集中区域面积就是黄石公园－92～93℃（美国）。1、低温对微生物的影响：微生物对低温具有抵抗力，绝大多数微生物所处的环境温度降低到最低生长温度时，微生物的新陈代谢活动减弱到最低程度，最后处于停滞或休眠状态。这时微生物的生命活动几乎停止，但能在较长时间内保持生命，少数要发生死亡。芽孢、孢子＞球菌＞G+杆菌低温用于食品的保藏：

寒冷温度：室温与冷藏温度之间，保藏期短，适于果蔬保藏。14—15℃。

冷藏温度：微生物的生命活动显著降低，但一些嗜冷菌可缓慢生长。适于蔬菜、果品、鱼、肉、蛋、乳类短期保藏。0-7℃。

冻藏温度：0℃以下的温度，一般冻肉在-18℃保藏，可在较长的时间内保藏食品。-18℃几乎可以抑制所有微生物的生长。橙子2-9℃香蕉10-11℃葡萄0-1℃柠檬4℃梨–05-1℃芒果6-12℃2、高温对微生物的影响：敏感，一般超过微生物的最高生长温度，敏感的微生物就会死亡。高温致死的机理：菌体蛋白变性，同时破坏了酶的结构，酶的活性消失了，代谢也就停止了。高温灭菌的方法：(1)热（力致）死时间（ThermalDeathTimeTDT）

是指在特定的条件和特定的温度下，杀死一定数量微生物所需要的时间，称热力致死时间。(2)D值（Decimalreductiontime）

在一定温度下加热，活菌数减少一个对数周期（即90%的活菌被杀死）时，所需要的时间（分），即为D值。测定D值时的加热温度，即在D的右下角表明。例如：含菌数为105/毫升的菌悬液，在100℃的水浴温度中，活菌数降低至104/毫升时，所需时间为10分，该菌的D值即为10分，即D100=10分。如果加热的温度为121.1℃（250℉），其D常用Dr表示。

(3)Z值

如果在加热致死曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短90%的加热时间）所需要升高的温度（℃），这所需要升高的温度数，即为Z值。

3、高温灭菌的方法：（1）干热灭菌法：A火焰灭菌法：特点：速度快、灭菌彻底、效果好。应用范围：废弃物。B干燥加热空气灭菌法：150-160℃，1-2小时。应用范围：玻璃器皿，金属及其他干燥耐热物品的灭菌。玻璃器皿要烘干。（2）湿热灭菌(moistheatsterilization)（A）煮沸消毒法物品在水中100℃煮沸15分钟以上，可杀死细菌的营养细胞和部分芽孢，如在水中加入1%碳酸钠或2~5%石炭酸，则效果更好。这种方法适用于注射器、解剖用具等的消毒。（B）巴氏灭菌

(pasteurization)灭菌的温度一般在60~85℃处理15~30分钟，可以杀死微生物的营养细胞，但不能达到完全灭菌的目的，用于不适于高温灭菌的食品，如牛乳、酱腌菜类、果汁、啤酒、果酒和蜂蜜等，其主要目的是杀死