水环境毒理学

水环境毒理学兔兔姥姥主要内容水环境分子生物标志物12水体农药类内分泌干扰物3分子生物标志物在监测水体重金属中的应用1.水环境分子生物标志物水生生物与其生存环境构成相互依赖、相互影响的动态系统,水体污染对水生生物产生威胁,同时生物也会做出相应的反应和变化。因此水生生物反应和变化可作为水环境评价的良好指标。目前广泛使用的污染指示生物有藻类、藤壶、浮游生物、软体动物、甲壳类、贻贝、牡蛎等,以及各种鱼类,特别是各种底栖鱼类,如:牙鲆、蝶类。近年来,细胞或分子水平上的生物标志物作为污染物暴露和毒性效应的早期预警指标受到广泛关注,并已成为国内外生态毒理学研究的热点之一,由于其具有特异性、预警性和广泛性等特点,在水环境生态风险评价中的应用日益广泛。国际毒理界对引起生物系统损伤的估算,包括污染物暴露、敏感性等生物标志物的研究极为重视1.水环境分子生物标志物抗氧化酶用作生物标志物抗氧化酶在参与活性氧的清除及机体的保护性防御反应中发挥巨大作用。超氧化物歧化酶(SOD)是最先与活性氧自由基作用的酶,它可将超氧阴离子(O2-)分解为H2O2

和O2,过氧化氢酶(CAT)又可继续分解H2O2,从而降低体内H2O2的浓度。除过氧化氢酶外,谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)也可利用H2O2

将还原型谷胱甘肽(GSH)氧化生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)。谷胱甘肽硫转移酶(GST)作为第二阶段解毒酶,可催化污染物与GSH结合,生成极性小分子物质,从而减轻其毒性。生物体的抗氧化酶对污染物胁迫相当敏感,其活性变化可为污染物胁迫下的机体氧化应激提供敏感信息,因此,抗氧化酶被用作指示环境污染的早期预警,从而成为分子生态毒理学生物标志物研究的热点之一。

有机污染物如2O#柴油和2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)在较低浓度下便可引起机体的氧化应激和氧化损伤[13],SOD、GST和GSH等对2种污染物的响应都很敏感,柴油和2,4-二氯苯酚在国家现行渔业用水标准以下(0.005mg/L),都能引起抗氧化酶活性。研究发现,Cu在低于我国现行渔业水质标准(0.01mg/L)时,能对GST产生显著诱导,表明GST对Cu反应敏感,有潜力成为指示Cu污染的生物标志物。1.水环境分子生物标志物缺点

：用抗氧化酶的活性变化来指示水环境污染,不同的实验室和野外研究得到的结果不尽相同,甚至相反。如未发现污染物胁迫下GST活性发生显著变化,相反,PCDDs、PAHs或一些杀虫剂胁迫下,红鳟鱼、鲈科鱼以及翻车鱼体内GST活性降低。因此,GST能否作为理想的生物标志物指示环境污染还值得进一步研究。将SOD作为生物标志物研究时也出现类似的问题,VanderOost总结了20多个实验室的研究结果,发现SOD在污染物胁迫下做出的响应不尽相同,60%多的实验室未发现SOD活性产生显著性变化,20%的实验室发现SOD产生诱导,而大部分的野外研究表明SOD活性出现诱导。对CAT的研究,超过50%的实验室未发现CAT活性发生显著变化,大于20%的实验室研究表明,CAT活性受到抑制,而小于20%的实验室研究表明,CAT活性产生诱导。以上结果表明,抗氧化酶用作环境污染的早期预警指标,必须考虑其他环境因素如温度、溶解氧等的影响。环境条件的微小差异都可能导致酶活性产生变化。另外,生物种属间的个体差异以及年龄、性别、不同生长发育阶段等也可能影响酶活性的检测结果。总之,将抗氧化酶,如SOD、CAT、GST用作生物标志物指示环境污染的早期预警,需考虑多种因素的综合影响,在实验条件的操作上应严格控制,尽量减少可能产生的误差,以确保实验结果的真实可靠。1.水环境分子生物标志物非酶参与的小分子抗氧化物质用作生物标志物非酶参与的小分子抗氧化物质在机体保护防御过程中也发挥了不可替代的作用,这类物质包括还原型谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(VC)、生育酚(VE)等。GSH是一种小分子三肽,作为机体抵抗污染胁迫的第一道防线,对机体起保护作用主要表现在两个方面：其一,在谷胱甘肽硫转移酶的催化作用下,作为外源性污染物及其体内代谢产物所产生的亲电中间体的结合靶点,降低污染物的生物毒性;其二,作为抗氧化剂保护机体因各种由生理及污染胁迫而造成的氧化应激及氧化损伤,在清除活性氧如H2O2及·OH过程中发挥重要作用。生物体遭受污染物胁迫时,GSH含量降低,大量活性氧产生并积累,使机体处于氧化应激状态,此时,体内正常的氧化还原电位平衡机制被扰乱,还原型谷胱甘肽向氧化型谷胱甘肽(GSSG)转化,GSSG含量升高。健康的生物体,GSH/GSSG比值一般维持恒定且大于10∶1。生物体遭受污染胁迫时,该比值降低。因此,GSH/GSSG比值通常作为指示环境污染物引起生物体氧化应激的生物标志物。1.水环境分子生物标志物其他酶蛋白作为分子标志物的研究1.乙酰胆碱酯酶(AchE)

乙酰胆碱酯酶是一个经典的毒理指标,20世纪50年代末,Weiss就提出对自然水环境中极低浓度的有机磷杀虫剂,可用鱼脑或无脊椎动物的AchE活力受抑制程度来检测,这个方法随即为许多学者接受,在国内曾有这方面报道。现在一般已确认,20%以上的AchE被抑制证明暴露作用的存在,50%以上的AchE抑制表明对生物的生存有危害,这对检测非急性毒性极为有用。多年来,这项指标一直作为神经传导抑制剂的特异性生物标志物。最近报道表明这项生化指标也可指示单一重金属离子污染的存在和监测流动水体中有机农药含量及危害性。1.水环境分子生物标志物2.腺苷三磷酸酶(ATPase)

ATPase是生物体内重要的酶,存在于所有的细胞中,包括多种由不同离子活化及存在于不同细胞结构中的ATPase,在细胞的供能活动如离子平衡中起着重要作用。研究氯代烃农药的作用机制时,人们发现DDT对Na、K-ATPase、Mg-ATPase有抑制作用,并对多种污染物与生物体ATPase的关系作了更广泛的研究。已发现多种水生生物包括鱼、虾、乌贼、水生昆虫以及鱼的多种组织,如鳃、肾、脑的多种ATPase对不同的污染物均有反应,如有机氯农药、增塑剂、多氯联苯、金属离子、炼油废水等。尽管对不同生物、不同组织作用程度有差异,这可能是由于各种生物、各种器官的敏感性不同所致,但这种作用的存在是毫无疑问的。无论是离体实验或活体暴露,都表明有一定的剂量/效应关系存在,有的还具有典型的毒性效应曲线。酶实验与生物体功能损伤的相关研究已进行了近30年,由于多种类型的水污染物对ATPase有抑制作用,至今仍是一项评价污染压力的参数。1.水环境分子生物标志物3.鱼血清酶在临床医学上,测定血液中组织专一性的酶,是常用于诊断特定组织或器官损伤的方法。在水生态毒理学研究中,这些方法也被用于判断污染物的作用靶位,如用转氨酶、脱氢酶(LDH)来反映水污染物对鱼肝的损伤;山梨醇脱氢酶仅存在于肝脏,因而血中的山梨醇脱氢酶也被用于指示某些化学物对肝脏的亚致死作用;碱性磷酸酶由于对金属盐敏感也被用作中毒指标。虽然这些酶不是污染物的直接作用靶位,但由于能反映一般毒物所引起的专一性的器官损伤,因而得到较为广泛的应用。Folmar提出,利用一系列鱼血清中非专一性的生化指标包括酶、电解质和激素等可很好地指示化学污染物慢性暴露的影响。4.蛋白磷酸酶蛋白磷酸酶广泛存在于细胞中,对任何一种蛋白进行催化脱磷酸化作用。蛋白磷酸化与脱磷酸化是细胞内无所不在的反应,正是这两种反应的特定平衡协调着细胞内许多生化反应过程。若这两种反应中的任意一种改变了其活性,则由之而来的将是细胞内一系列生化反应的紊乱,包括肿瘤形成过程的促进。1.水环境分子生物标志物5.混合多功能氧化酶(MFO)

有机体的非生物物质的转化包括2个阶段:第一阶段,亲脂性底物被细胞色素P450依赖性的混合功能氧化酶(Mixedfunctionoxidase,简称MFO)代谢,将氧引入底物分子;第二阶段,内源性分子如葡萄糖醛酸、硫酸盐、谷胱甘肽等与被氧化的非生物物质结合,形成低毒而且易于排出的产物。这是非生物物质代谢的一般方式。生物体内解毒系统一个重要的特征是参与许多关键性解毒反应的酶是可通过暴露而诱导的,而许多环境污染物都是诱导物。因此,检测这种诱导作用,并用作指标来反映污染物暴露对生物的影响就成了分子生态毒理学研究的一个重要方面。酶的催化活力是证明MFO诱导作用存在最早和最常用的方法。在正常鱼中,由于EROD和AHH活力很低,有时无法测出,因此,检测EROD和AHH催化活力是确定鱼中诱导反应的最灵敏的方法。对胚胎进行诱导剂微量注射可看到孵化后鱼苗中肝EROD的诱导。用酶活力测定证明诱导作用存在,其方法较为成熟,但是酶活性的表达需要酶蛋白的一定结构的维持及辅因子的存在。由于野外条件的限制,诱导剂和内源性物质的存在,这些都会影响酶活性的表达,而且当样品量较少时(如鱼卵、鱼苗),酶活性测定较为困难。1.水环境分子生物标志物展望：目前,水体污染的生态风险评价研究正朝着多重性和实际性的方向发展。在现阶段的研究中,国内研究者的工作多集中在单一化合物和单一暴露途径的风险问题,这与现实的水体的生态系统不符合。作为要被研究的水生生物,往往暴露于来自多重途径的多种化合物的综合影响。而现在的研究多注重室内暴露和效应的关系,尚未很好地同野外实际相结合,另外对于水体中污染物对水生生物的毒性机理研究还不够深入。因此,水环境中分子标志物作为污染的早期预警的研究要重点放在:①多种因子的综合污染研究;②生物标志物在野外水体的真实环境的早期诊断和生态风险评价的应用研究;③污染物对分子标志致毒机理的深入研究。2.分子生物标志物在监测水体重金属中的应用重金属具有亲脂性、高富集性和难降解性，进入水体后容易在水生生物体内积累，并随着生物营养级的升高而增大，增加重金属的潜在危害；水体中的重金属还能对生物产生显著毒性作用。采用生物标志物作为敏感的生物效应“早期预警”工具，在环境质量评估中具有非常重要的意义。Goksoyr等提出：生物标志物是生物体暴露于亚致死剂量的有毒化合物时，在分子、细胞等水平上发生异常变化的信号指标。如果这些异常变化先于严重的结构损伤，标志物就有助于确定生物体所处的污染状态及其潜在危害，为严重毒性伤害提供早期警报。

2.分子生物标志物在监测水体重金属中的应用1.乙酰胆碱酯酶（AChE,acetylcholinesterase）乙酰胆碱酯酶(AChE)是一个经典的毒理指标。而选用AChE指示重金属离子污染的研究目前只有少量报道。AChE的活性中心由酯解部位、阴离子部位和疏水性区域3个主要区域组成，其中酯解部位含有丝氨酸和组氨酸。有研究表明，重金属暴露引起有机体AChE活性降低的一个原因就是重金属共价结合乙酰胆碱酯酶活性位点的丝氨酸，直接导致酶的活性丧失，另一方面可能是由于酶中大量巯基与重金属结合引起空间构想变化，从而间接引起酶活性降低。现有的研究结果表明，重金属会抑制暴露有机体的AChE活性，但多数是在水体重金属浓度较高或者长期暴露下才会产生，低浓度重金属或短期暴露条件对AChE活性的抑制不明显。与其它标志物（如金属硫蛋白）相比，AChE在敏感性和专一性方面均有差距，多种重金属对AChE联合毒性效应是今后的研究方向。2.分子生物标志物在监测水体重金属中的应用2.抗氧化防御系统

抗氧化防御系统，又称活性氧（ROS）清除系统，是一类分子生态毒理指标。抗氧化防御系统主要由抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化酶GPX等）和抗氧化非酶物质（如谷胱甘肽GSH、维生素C和维生素E等）组成。另外，脂质过氧化物、总氧自由基的清除能力、DNA的氧化和氧化还原状态等也可作为氧化损伤的生化指标。有研究表明，金属暴露可导致氧自由基或活性氧（ROS）产物的增加，从而引起抗氧化酶活力变化或非酶物质含量的变化，可作为监测重金属污染胁迫的指示指标，间接或直接反映环境中重金属污染的存在。VanderOost等提出海洋生物体内的抗氧化防御系统可以作为监测海洋污染状况的生物标志物，现在抗氧化参数已开始应用到野外环境监测中。但是抗氧化防御酶的活性能够随季节而发生变化，还会对环境中其它污染物质（如多环芳烃等）产生响应，获得重金属胁迫与抗氧化酶活性改变之间的剂量—效应关系仍然比较困难，这些均限制了抗氧化防御酶在环境监测中的应用。2.分子生物标志物在监测水体重金属中的应用3.腺苷三磷酸酶(ATPase)腺苷三磷酸酶(ATPase)是生物体内重要的酶，几乎存在于所有生物的细胞膜上，负责细胞内外的离子转运与交换，在细胞的供能活动（如离子平衡等）中起着重要作用。已有较多研究表明，水生生物体内多种ATPase对重金属离子的暴露非常敏感。体外暴露，重金属能够降低ATPase活性，而体内暴露可能涉及各种补偿机制或稳态机制，影响较为复杂。生物体Na/KATPase活性与重金属暴露浓度或体内重金属含量之间不仅具有良好的剂量—效应关系和时间—效应关系，而且还具有组织差异性。另外，Ca2+-ATPase也能对水环境中重金属胁迫产生响应。不同金属离子对Ca2+-ATPase活性的抑制效应不同，Hg2+和Cu2+影响最显著，Zn2+和Cd2+次之。这种抑制效应差异可能是由于金属离子与酶上特定的巯基（-SH）亲和力不同所导致，Hg2+(Cu2+)与Zn2+(Cd2+)相比有较高的巯基亲和力，因此对酶的抑制效果显著。2.分子生物标志物在监测水体重金属中的应用4.DNA损伤脱氧核糖核酸(DNA)存在于所有活的有机体中，携带遗传信息。任何非程序的DNA分子结构改变都会导致严重的生物学上的突变。一些环境化学物质和物理因子被分类定为遗传毒性物质，这些物质能够损伤DNA分子结构，通常伴随着不利于生物完整性的影响。因此特殊类型的DNA结构损伤可以视为污染暴露的生物标志物。一些常见的由遗传毒物引起的DNA结构修饰总结见表1.2.分子生物标志物在监测水体重金属中的应用另外，检测DNA结构损伤也是分子生物标志物的重要研究内容。目前主要的检测手段有：DNA断链检测（彗星试验、碱性解链实验、非程序DNA合成试验）、微核试验(PCE)、DNA加合物试验（32P后标记法）、DNA甲基化水平等。Garman等将海胆胚胎分别暴露于3种重金属溶液(As5+、Ni5+、Cr6+)中，48h后，畸变和DNA蛋白质交联(DPCs)率增加。3种重金属致畸的最低可观察效应浓度分别是As5+(0.011mg·L-1)、Ni5+(0.40mg·L-1)、Cr6+(2.5mg·L-1)；导致DPCs反应的最低可观察浓度分别是As5+(0.023mg·L-1)、Ni5+(8.0mg·L-1)、Cr6+(10.0mg·L-1)；海胆胚胎受金属暴露后DPCs水平均显著增加，其中As和Ni两种金属与DPCs之间存在剂量—效应关系。朱国念等发现混合重金离子的毒性作用会引发鲫鱼鳃和肝脏组织细胞DNA断裂，DNA修复过程中掺入大量标记过的3H-胸腺嘧啶核苷，浓度低时掺入量明显高于对照组，而高浓度时掺入量反而降低；肝脏DNA总甲基化水平升高也表明鱼组织细胞DNA的断裂。2.分子生物标志物在监测水体重金属中的应用5.金属硫蛋白(Metallothioneine，MT)金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一种富含金属(Ag、Au、Bi、Cd、Hg、Zn等)和半胱氨酸的低分子质量的蛋白质，MT在体内被金属和其它因素诱导而合成，具有重要的生物学功能，如清除体内自由基、防止机体衰老；重金属调节和解毒功能；参与体内微量元素的代谢；增强机体对应激的适应能力等。MT分子中含有大量巯基(-SH)，而巯基与金属离子具有很强的亲和力，因此MT分子对金属尤其是有毒的重金属如Ag、Cd、Cu、Hg和Zn等有很强的结合力。生物体调节必需金属元素已具有一定的MT基础水平，当周围环境中和生物体内的金属含量超过一定浓度时，才能诱导合成新的MT，且这种诱导水平与环境中的金属浓度有直接相关性。根据这一特性，有研究者提出利用水生生物MT水平作为水生生物受重金属胁迫的分子生态毒理学诊断指标，凭此进行水环境的监测、管理和保护。2.分子生物标志物在监测水体重金属中的应用通过野外实验，发现生物体内MT水平对水环境中重金属具有指示作用。Linde等从污染区和对照区分别采集的生物样品中发现，污染区褐鳟鱼(Salmotrutta)和欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)肝脏MT含量均高于未污染区，并且两个区褐鳟鱼肝脏MT水平具有显著的统计学差异，从而提出褐鳟鱼肝脏MT适合作为指示重金属污染的生物标志。但是，MT对重金属暴露的响应可能会受到多方面因素干扰。例如，生物体接触的金属浓度过高，暴露时间过长，金属结合蛋白的合成过程会被严重干扰。另外，MT在生物体内的诱导具有组织差异性，肝脏是MT合成的主要器官，诱导效果优于其它部位。Lecoeur等研究Cd/Cu暴露对双壳类斑马贻贝(Dreissenapolymorpha)的影响，发现该生物体的MT指标与Cu的相关性并不显著，认为测定的是生物全部组织样品，掩盖了特征器官的一些显著反应。除此之外，水体盐度、季节变化、生物种类等内外因素均可影响MT的含量，从而导致MT研究经常出现试验结果不一致性的情况，可见利用生物体内MT作为接触重金属污染的生物标志物仍需进行广泛而深入的研究。2.分子生物标志物在监测水体重金属中的应用（1）生物有个体差异和种间差异性。选择不同生物体内分子标志物监测水体重金属污染，发现同样暴露条件下的标志物变化规律并不相同，各实验室之间的数据无法横向比较，甚至得到相反的结论。为了监测规范化和监测结果的可重复性，离体生物标志物以及“标准化”生物标志物将会成为今后研究的热。（2）生物标志物对重金属响应过程容易受到外界环境因素如温度、盐度、pH以及体内因素如年龄、性别等的影响。因此可考虑综合应用多种生物标志物诊断重金属对水生生态系统产生的影响。（3）加强重金属对水生生物致毒机理方面的研究。水体中重金属可在生物体内积累并随着生物营养级的升高而放大，某些重金属还能在生物体内发生转化，毒性增强。研究重金属的致毒机理有助于解释生物体受重金属胁迫后体内各种标志物的变化规律，以便完整地评价重金属的生态风险性。展望：3.水体农药类内分泌干扰物

1996年3月Colborn等对人工合成化学品在环境和食品中的残留、积累以及对人类内分泌特别是生殖功能的干扰提出了警告,在世界范围内引起了对内分泌干扰物(endocrine-disruptingchemicals,简称EDCs)的高度重视和广泛的研究.近年来,环境内分泌干扰物对人类和野生生物的有害影响已成为了国际性的热点问题.美国国家环保局(USEPA)在1998年8月公布了筛选出的内分泌干扰物,从86000种商用品和化学品中筛选出了67种(类)危及人体和生物的“内分泌干扰物质”.这些化合物性质差异极大,既有难降解的二噁英、多氯联苯、有机氯农药、邻苯二甲酸酯,又有易分解的极性除草剂、杀虫剂,还有金属有机化合物、洗涤剂降解物等.其中,农药类有44种(包括2种代谢中间产物),几乎占三分之二,这些农药被称为农药类内分泌干扰物(endocrinedisruptingpesti-cides)(如表1).3.水体农药类内分泌干扰物3.水体农药类内分泌干扰物1.农药类内分泌干扰物的特点

1.1性质特点

农药类内分泌干扰物一般具有亲脂性、化学性质稳定、不易被降解、易挥发和残留期长等特点.可通过生物富集和食物链的放大作用引起体内富集.进入机体以后,生物半衰期较长,可在机体内长期蓄积,难以生物降解,不易被排出甚至根本不被排出。

1.2结构特点

农药类内分泌干扰物包括有机氯类,有机磷类,氨基甲酯类,除虫菊酯类,二硫代类,及其他不同类的农药.这些不同类的农药类内分泌干扰物虽然具有不同的化学结构,但具有相似的内分泌干扰功能。

3.水体农药类内分泌干扰物1.3作用特点由于农药类内分泌干扰物应用普遍,在环境中存在广泛,导致机体长期处于低剂量暴露中.尽管农药类内分泌干扰物与天然激素相比效应强度较低,但由于正在发育的机体内分泌系统尚缺乏反馈保护机制抑或因为幼体的激素受体分辨能力不如成体的那样高,使得孕期、幼年动物和人体对激素水平远较成体敏感,激素水平的微量改变即可影响动物终生.而且由于亲代的暴露