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文档简介

克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法

一、细胞计数

这是细胞培养中常用的基本技术之一。所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。

细胞计数的基本步骤：

(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.

(2)取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.

(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。代入下式得出细胞密度。

细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数

台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。此外还可用0.02%的藻红B染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。

细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）×100%

细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。

在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。

二、细胞生长曲线和生长倍数

细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。

测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。

也可采用MTT法来进行生长曲线测定，较上述方法简便。

标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过一段时间的潜伏期，再进入对数生长期，达到平台期和生长稳定，最后衰老。

细胞生长倍数是指测定接种时活细胞的浓度，经一个生长周期达到最大活细胞浓度的比率。

生长倍数=培养后最大活细胞浓度/接种时的活细胞浓度

三、细胞分裂指数

细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标。它以被测1000个细胞中的分裂细胞数来计算。其方法为：用秋水仙素将细胞处理1～2小时后，按染色体制片法制片并染色，计算1000个细胞中分裂相的数目，重复4次取平均值，用百分比表示。

基本步骤：

(1)细胞准备

用盖片(支持物)培养法。

(2)每24小时取出一个小玻片，按常规方法进行固定，吉姆萨或HE染色，封片，制成永久标本。

(3)显微镜下选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞并计数。逐个视野进行，对每一时间组的玻片各取细胞多、中、少3个区域各一区，共数1000个细胞，计算出平均分裂相值所占百分比。观察时要掌握好

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