轮藻提取物抑菌作用研究

PAGEPAGE9轮藻提取物抑菌作用研究学生：王琪指导教师：谢树莲李砧摘要以轮藻的乙醇提取液作为抑菌剂进行抑菌试验。结果表明不连续轮藻（娘子关）的醇提液对三种模式菌均无抑制作用；拟丽藻和普生轮藻的醇提液对大肠杆菌无抑制作用，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有较明显的抑制作用，并且对金黄色葡萄球菌的抑制作用存在显著的种间和地域差异，其中以拟丽藻（晋祠）醇提液的抑菌效果最好；最低抑菌浓度分别为：拟丽藻（晋祠）和普生轮藻（晋祠）的醇提液对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为生药浓度10%；拟丽藻（晋祠）醇提液对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为生药浓度13.3%，普生轮藻（晋祠）的醇提液对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度大于生药浓度20%。关键词轮藻；提取物；抑菌作用；最低抑菌浓度近年来，由于抗生剂或其他化学合成剂的滥用，使致病菌的抗药性不断增强，出现耐药性很强的变种，此外，还造成了一些严重的问题，如环境污染、生态失衡等非靶标生物目标。这就需要开发一些天然的抑菌剂[1]，而植物源杀菌剂恰因其具有选择性强、安全、易降解等优点，越来越受到国内外研究者的亲睐。植物源抑菌剂是利用某些植物里含有的某些抗菌物质或诱导产生的植物防卫素，杀死或抑制某些病原菌的生长发育。目前已报道的有139种植物，主要集中在种子植物中。从抑菌植物中分离的抑菌物质的主要结构类型有萜类、生物碱类、酯类、坩类、醇类等化合物，几乎涉及各类植物成分[2]。轮藻属绿藻门,是大型沉水藻类植物，分为1纲、3目（直立轮藻目、右旋轮藻目、左旋轮藻目），现存仅左旋轮藻目的轮藻科，含6属，约400种,其分布遍及全球。中国也是轮藻的主要产地，记有5属、152种、39变种，在各种淡水及半咸水中都能见到，分布十分广泛[3]。具有关报道，生长轮藻的水域中没有孑孓生长[4～5]菌体的熏烟可以驱蚊，因此，轮藻中应有一定的杀虫抑菌成分，对其抑菌性进行研究，可以作为筛选和开发药用轮藻植物资源提供资料，也可为寻找新的具有抑菌或杀菌作用的植物资源提供科学依据，其提取物还有望用于食品天然防腐剂的开发、利用等[6]。1材料与方法１.１材料与试剂普生轮藻，于2006年三月采于山西晋祠；拟丽藻，于2006年三月采于山西晋祠；不连续轮藻（娘子关），于2006年四月初采于山西娘子关；普生轮藻，于2006年四月末采于山西洪洞广胜寺。烘干研碎，放于广口瓶中保存[7]。95%乙醇，由天津市天心精细化工开发中心生产；牛肉膏，由北京奥博星生物技术责任有限公司生产；蛋白胨，由北京奥博星生物技术责任有限公司生产；琼脂，由福建泉州市泉港化工厂生产；氯化钠，由北京化工厂生产。所用试剂均为分析纯。2供试菌种实验菌株选用[8]：大肠杆菌（Escherichiacoli）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）。大肠杆菌（革兰氏阴性细菌）的数量是水源和食物被污染强度的标志，枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性细菌）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）在空气中分布较多。以上菌种均由山西大学微生物教研室提供。1．３培养基牛肉膏蛋白胨培养基[9]：取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000ml，加热溶化，调pH值为7.0，分装于三角瓶中，4主要仪器索氏（Soxhlet）提纯器，旋转蒸发仪，超净工作台，ZDX-35B1型座式自动电热压力蒸汽灭菌器，DH4000A型电热恒温培养箱，容量瓶，三角瓶，蒸发皿，培养皿，移液管，涂布棒，酒精灯，游标卡尺，物理天平，电子天平。１．5轮藻醇提液的制备1.5.1Soxhlet提取法称取10g轮藻粉末，放入150mlSoxhlet提纯器中，按照固液质量比1：10，在圆底烧瓶中加入100ml的95%乙醇，92℃下水浴加热回流提取10-12h，到提取液颜色较浅为止，待冷凝液刚刚虹吸下去时，即可停止加热。稍冷却后，改成旋转蒸发装置，把提取液中大部分乙醇蒸出（回收），被浓缩的提取液再用容量瓶定容到50ml,即得轮藻的醇提物。1.5.2提取物不同浓度溶液制备由于抑菌实验选用的是不同提取物，因此须计算为同一当量进行抑菌实验比较[10]，记1g生药溶于10ml95%乙醇中为生药浓度1：1的溶液。由此，1.5.1中获得的醇提物的浓度为1：5。取1∶5浓度的溶液于小玻璃瓶中,用梯度浓度配比法配成浓度分别为1：6、1：7.5、1：8、1：10、1：12、1：20的各提取物的醇溶液。1.6供试菌悬液的制备将供试的各种菌种进行斜面活化[11]，取一定量已活化的供试菌于装有9mL液体培养基中培养12h，再取0.5ml含供试菌的液体培养基放入19.5ml的无菌水中，制成菌悬液，用梯度涂平板法测得菌体个数1012～1013个/mL，备用。１．7抑菌试验１．7．１纸片法[12]测定抑菌效果选用双圈牌定量滤纸201和GenuineWhatmanFilterPaperNo.41两种滤纸，用打孔器打成直径(φ)为５mm圆形小纸片，置于洁净干燥的小培养皿中，干热灭菌（120℃,２h，严格控制温度以避免纸片自燃[13]），在超净台上，向已灭菌的培养皿中加入约15毫升己溶化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基，于台面上轻轻摇匀，制成平板。每个平板中加入0.5mL已制备好的菌悬液，用无菌涂棒涂布均匀，再用无菌镊子贴滤纸圆片，每皿贴浸泡过一种提取液的滤纸片4片，每皿5个重复，于37℃培养24h1．7．2数据处理与统计用游标卡尺分别测量每个抑菌圈的横径和纵径，取其平均值，用SPSS13.0forwindows软件进行统计分析数据。1．7．3最低抑菌浓度（MIC）测定[15]在超净台上，向已灭菌的培养皿中分别加入生药浓度为1：6、1：7.5、1：8、1：10、1：12、1：20的醇提液1ml，一种提取液一个浓度做3个重复。然后向各个培养皿内，分别加入约15毫升己溶化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基，台面上轻轻摇匀，制成平板。每个平板中加入0.5mL已调整浓度为106-107个菌体/ml的菌悬液，用无菌涂棒涂布均匀。将培养皿倒置放入恒温箱中,37℃恒温培养，24h、48h、72h后分别观察菌落２结果与分析1实验结果2.1.1纸片比较实验实验数据记录见附表1至附表6。不同滤纸对醇提液抑菌效果的影响，见方差分析表1表1纸片比较实验方差分析结果SumofSquaresdfMeanSquareFSig.BetweenGroups1.01511.015.890.353WithinGroups34.240301.141Total35.255312.1.2纸片法测定抑菌效果本实验于3月26号、4月14号、4月26号、5月10号、5月18号和5月19号做了六次重复，实验结果记录见附表1至附表6。2.1.2.1四种轮藻的醇提液对金黄色葡萄球菌的抑制作用比较，见方差分析表2。表2四种轮藻的醇提液对枯草杆菌抑制作用的方差分析结果SumofSquaresdfMeanSquareFSig.BetweenGroups2.71521.3571.3120.275WithinGroups79.676771.035Total82.390792.1.2.2四种轮藻的醇提液对枯草杆菌的抑制作用比较，见方差分析表3表3四种轮藻的醇提液对金黄色葡萄球菌枯草杆菌抑制作用的方差分析结果SumofSquaresdfMeanSquareFSig.BetweenGroups16.21528.10812.002.000WithinGroups74.9821110.676Total91.1971132.1.2.3拟丽藻（晋祠）醇提液对三种细菌的抑制作用比较，见方差分析表4因拟丽藻和普生轮藻醇提液对大肠杆菌无抑制作用，故下面只比较对另两种菌的抑制作用表4拟丽藻（晋祠）醇提液对两种细菌的抑制作用的方差分析结果SumofSquaresdfMeanSquareFSig.BetweenGroups1.82011.8201.484.227WithinGroups96.865791.226Total98.685802.1.2.4普生轮藻（晋祠）醇提液对两种细菌的抑制作用比较，见方差分析表5表5普生轮藻（晋祠）醇提液对两种细菌的抑制作用的方差分析结果SumofSquaresdfMeanSquareFSig.BetweenGroups1.64411.6443.403.069WithinGroups34.77572.483Total36.418732.1.2.5普生轮藻（广胜寺）醇提液对两种细菌的抑制作用比较，见方差分析表6表6普生轮藻（广胜寺）醇提液对三种细菌的抑制作用的方差分析结果SumofSquaresdfMeanSquareFSig.BetweenGroups.7601.7601.205.279WithinGroups23.32437.630Total24.083382.1.3最低抑菌浓度（MIC）实验结果，见表7表7最低抑菌浓度实验浓度B.sE.cS.a24h48h72h24h48h72h24h48h72h空白对照1ml无菌水数不清--数不清--数不清--酒精对照1ml95%酒精数不清--数不清--数不清--拟丽藻(晋祠)1:50数不清-数不清--00901:7.50数不清-数不清--00681:8数不清0001:10数不清--数不清--021991:20数不清--普生轮藻(晋祠)1:51数不清-数不清--021021:6数不清0001:7.5数不清--数不清--031991:10数不清--数不清--032251:12数不清--注：“0”表示未观察到菌落生长；“-”表示未进行此次实验结果观察。2.2结果分析2.2.1纸片比较实验由表1知，在纸片比较实验中，F=0.890，P=0.353>0.05，因此认为两种滤纸对实验效果无显著影响，可任选其一。下面的实验都选用了双圈牌定量滤纸201进行。2.2.2纸片法测定抑菌效果2.2.2.1检验四种轮藻醇提液的抑菌效果是否存在种间或地域差异从附表2-附表6可以看出，不连续轮藻（娘子关）的醇提液无抑菌圈，与其他三种醇提液存在显著差异，因此方差分析时，只考察拟丽藻（晋祠）、普生轮藻（晋祠）与普生轮藻（广胜寺）三种醇提液的实验数据。表2显示，F=1.312,P=0.275>0.05,由此认为三种轮藻的醇提液对枯草杆菌的抑制作用差异不显著。表3显示，F=12.002，P=0.000<0.01，由此认为三种轮藻的醇提液对金黄色葡萄球菌的抑制作用差异极显著。2.2.2.2检验轮藻醇提液对三种细菌的抑制作用是否存在差异由附表1-附表6看出，四种轮藻醇提液对大肠杆菌都无抑制作用。对于金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑制作用比较，分别分析了拟丽藻（晋祠）、普生轮藻（晋祠）与普生轮藻（广胜寺）三种醇提液的实验数据。由表4、表5、表6方差分析的结果可知，拟丽藻（晋祠）、普生轮藻（晋祠）、普生轮藻（广胜寺）三种醇提液对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑制作用差异都不显著。2.2.3最低抑菌浓度（MIC）实验分析表7数据，可见，随着生药浓度的增大，轮藻醇提液的抑菌作用也增大。根据最低抑菌浓度的定义，可确定轮藻醇提液的最低抑菌浓度，见表8表8四种轮藻醇提液的最低抑菌浓度（生药浓度）菌种拟丽藻（晋祠）普生轮藻（晋祠）S.a1:101:10B.s1:7.5>1:5E.c无无3结论在纸片法测定抑菌效果的实验中，纸片的持药量会影响到抑菌圈的直径。因此首先做了双圈牌定量滤纸201和GenuineWhatmanFilterPaperNo.41两种纸片的比较实验。经统计分析实验数据，发现这两种滤纸对实验效果无明显影响。后续实验，都采用双圈牌定量滤纸201进行。用索式提取法获得的轮藻醇提液中，不连续轮藻（娘子关）对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和大肠杆菌都无抑制作用；拟丽藻（晋祠）、普生轮藻（晋祠）与普生轮藻（广胜寺）三种醇提液则对枯草杆菌的抑制作用无显著的种间或地域差异，对金黄色葡萄球菌的抑制作用存在种间和地域差异，而对大肠杆菌无抑制作用。在单一醇提液对三种细菌的抑制效果比较中，发现它们对大肠杆菌都无抑制作用，对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌有差异不显著的抑制作用。这可能与轮藻中的抑菌成分以及菌种的不同特性有关，需进一步实验验证。参考文献：[1]马庆一，卫军。天然色素作为防腐剂的筛选与应用研究（—）[J]。食品科学,2002,(5):121-124.[2]王兴华。多种药用植物抑菌效果研究[J]。山西大学报，2005，28（3）：322-324[3]韩福山,李尧英。中国淡水藻志(轮藻门),1994,3[4]JSZaneveld.TheCharophytaofMalaysiaandAdjacentCountries.Blumea,1940,5:38-41[5]EllaAGonzalves,BSVaidya.OntheLarvicidalPropertiesofCharophytes.Hydrobiologia,1963,21:188-192[6]熊大胜，席在星，邓应威。鱼腥草提取物抑菌作用研究[J]。常德师范学院，2002，14（4）：59-60[7]庄惠如，卢海声，朱绵，吴文珊，李晨霞。药用蕨类水提取液和醇提液平板细菌试验初报[J]。福建师范大学学报，2000，16（3）：83-86[8]吴传帽，吴周和，陈雄。甘草提取液的抑菌作用研究[J]。现代商贸工业，2000，4：49-50[9]沈萍，范秀容，李广武。微生物学实验第三版高等教育出版社50-54[10]时维静，路振香，焦坤。白头翁根不同提取物体外抑菌试验研究[J]。中兽医医药杂志，2005，4：26-28[11]刘风珠，卫军，牛小明。芦荟的抑菌作用及在保鲜中的应用[J]。食品研究与开发，2003，4（24）：111-112[12]黎满香，刘红旗，陈可毅，蒋武成，王吉祥。试管法和纸片法抑菌试验的比较[J]，中国兽医科技，1997，27（2）：31-32[13]樊金拴，李晓明，曹玉美，韩玲，侯小蕊。巴山冷杉精油抑菌作用研究[J]。西北林学院学报，1998，13（3）：50-55[14]李东生，王金华。荸荠叶茎提取物抑菌作用研究[J]。粮油加工与食品机械，2003，10：76-77[15]胡春菊，严赞开。药用仙人掌提取物的抑菌试验[J]。贵州农业科学，2004，32（3）：58StudiesoftheAntibacterialActivityofExtractsofCharophytesWANGQiAbstract：TheethanolextractsfromfourdifferentCharophyteswereusedasantimicrobialagentsinthispaper.TheresultsshowedthattheextractsfromCharainconnexacouldnotinhibitanykindofthethreebacilli,whiletheextractsfromNitellopsisobtusaandCharavulgarisexhibitedsomeantibacterialactivityagainstS.aureusandB.subtilis,anddidnotinhibitE.coli.TherearedifferencesamongtheantibacterialactivitiesofthefourkindsofextractsagainstS.aureusintheeffect,withtheextractsfromN.obtusainJinciStramthehighest.Theminimuminhibitoryconcentrations(MIC)were:theextractsfromN.obtusaandC.vulgarisagainstS.aureuswere1:10;theextractsfromN.obtuseagainstB.subtiliswas1:7.5;andtheextractsfromC.vulgarisagainstB.subtiliswashigherthan1:5.Keywords：Charophytes；extracts；antibacterialactivity 感谢谢树莲、李砧老师在毕业设计实验中给予的指导和帮助！附表1轮藻醇提液的抑菌圈直径（3.26）/mm供试菌种拟丽藻（晋祠）普生轮藻（晋祠）滤纸一滤纸二滤纸一滤纸二S.a10.007.357.357.006.507.056.708.257.756.957.556.707.257.156.706.90B.s6.055.006.006.005.955.006.006.006.255.006.006.005.005.006.006.00E.c无附表2轮藻醇提液的抑菌圈直径（4.14）/mm供试菌种拟丽藻（晋祠）普生轮藻（晋祠）不连续轮藻（娘子关）S.a7.757.25-8.108.00-7.508.00-8.707.90-7.25--7.00--7.50--8.25--B.s7.857.25-8.107.00-8.257.00-7.60--8.90--8.25--B.s7.50--7.75--E.c附表3轮藻醇提液的抑菌圈直径（4.26）/mm供试菌种拟丽藻（晋祠）普生轮藻（晋祠）不连续轮藻（娘子关）普生轮藻（广胜寺）S