透射电镜成像设备的应用

透射电镜成像设备的应用

0透射电镜的特征科技的进步和微观技术的发展对微观技术的需求是很大的。这是20世纪30年代发明的透射电镜。透镜的出现和不断完善又进一步从广度和深度上开拓了科学研究的疆域。透射电镜是利用电子与样品的相互作用获取样品信息的:从电子枪发出的高速电子束经聚光镜均匀照射到样品上,作为一种粒子,有的入射电子与样品发生碰撞,导致运动方向的改变,形成弹性散射电子;有的与样品发生非弹性碰撞,形成能量损失电子;有的被样品俘获,成吸收电子。作为一种波,电子束经过样品后还可发生干涉和衍射。总之,均匀的入射电子束与样品相互作用后将变得不均匀,这种不均匀依次经过物镜、中间镜和投影镜放大后在荧光屏上或胶片上就表现为图像对比度,它反映了样品的信息。早期人们只能通过荧光屏观察图像,通过胶片记录图像及进行学术交流。所以,透射电镜一般都配有大、小荧光屏(观察、精确对焦荧光屏),片夹式照相机用以观察和记录透射电镜图像;还有35mm照相机接口可用来选装35mm卷片式照相机以及底部法兰可用于选装其它透射电镜附件。近20来年更是出现了各种各样的电子式透射电镜成像设备。1传统的透射电镜成像方法1.1蓝色电镜的观察实现与显像管荧光屏一样,透射电镜荧光屏也是通过高速电子轰击荧光粉从而把电子图像转变成肉眼可见的光学图像。电镜的合轴、视场的选择、感兴趣区的寻找、合适放大倍数的确定等操作都要通过对荧光屏的观察实现;有些电镜荧光屏还是底片自动曝光的传感器。虽然人眼在最佳光照条件下的点极限分辨率可达100μm,但荧光屏的亮度远远弱于这个最佳条件,因此直接观察电镜荧光屏的点最佳分辨率约为350μm。电镜一般都有一个小荧光屏和与此对应的约十倍的观察放大镜,通过它们观察时的点最佳分辨率约为35μm,但这时视野非常小,一般只是用于照相时的精确对焦。可以看出,实时成像是荧光屏的最大优势,但其分辨率低,无法记录图像信息。更重要的是荧光图像的亮度很低,容易引起电镜工作者的视觉疲劳,影响工作质量。1.2胶片或正片透射电镜都安装有片夹式照相机。照相机主要分送片盒和收片盒两部分,一般可容纳几十张胶片。照相时,片夹载着胶片被移动到主荧光屏下面,经电子束照射而曝光形成潜影,曝光结束后片夹被送回到收片盒。经过冲片、洗片,得到电镜图像(负片或正片)。电镜一般使用低感光度的电子感光片,其感光物质卤化银晶体的颗粒小,形成影像的反差高。电镜胶片的空间分辨率很高,至少100线/mm,即点分辨率最低10μm,考虑人眼在最佳光照、最好视距的极限点分辨率为100μm,电镜胶片可按十倍放大印照片。由于片夹式照相机与电镜镜筒直通,为了不影响镜筒的真空度,一般要待所有胶片都曝光后才会收片和重新装片,不能即装、即照、即取,时效性差。如果曝光剂量合适、冲片和洗片都控制得很好,胶片成像能得到最好的透射电镜影像品质。但由于胶片成像费时长、成像环节多,容易受环境和人为因素影响,要得到高品质的影像并不容易。暗室冲片和洗片本身就是技术性很强的工作,需要长时间的经验积累;暗室工作还费时、费力、费神。2过投影室的图像记录随着半导体图像传感器(CCD、CMOS)技术、计算机技术的快速发展,出现了各种各样的电子式透射电镜成像设备。从安装部位的不同看,有的通过35mm照相机接口装在电镜上;有的通过投影室的底部法兰进行正轴或偏轴安装。从功能上来看,有的侧重于图像的实时观察;有的主要用于感兴趣区显微图像的记录;有的兼顾上述两方面功能。从所使用的图像传感器特性看,反映对比度分辨率的像素深度至少12比特,有的高达16比特。而在空间分辨率上,有低分辨率的,约40万像素;中等分辨率的,(100-400)万像素;高分辨率的,(400-1600)万像素。另外,在软件方面,基于计算机技术和透射电镜图像的数字化存储,越来越多的透射电镜图像分析和处理软件被开发出来,大大丰富了透射电镜的成像手段,扩展和增强了透射电镜的分辩能力。2.1模拟图像的图像合成和数字视频技术早期的透射电镜电子式成像装置其实就是工业电视在透镜成像上应用。这些装置的摄像机输出标准的CCIR(25/625)或EIA(30/525)信号,显示在标准9英寸或12英寸监视器上,能使用标准的录像设备录像。它们的主要目的是替代电镜的主荧光屏,以减轻工作人员的劳动强度;同时由于监视器上的图像可在普通室内光照条件下被多人观看,方便教学。典型的如GatanModel622SC,该装置通过透镜底部法兰正轴安装。它使用影像增强器增强荧光图像信号,用Newvicon摄像机以提高灵敏度,因此可用于低剂量显微成像。另一种如GatanModel673,安装部位在35mm照相机接口,具有很大的视场;使用均匀性很好的YAG闪烁体进行电光转换,减少了噪声;用光纤耦合,大大提高了效率,避免了几何失真;图像传感器为CCD。这类设备的主要问题有:(1)由于图像传感器成像面积小、每帧图像能记录的信息少,与传统胶片有很大差距。(2)它们只输出模拟视频信号,无法直接进行数字化存储、处理。以至于后来出现一些在通用计算机上配置一块视频采集卡对模拟视频信号进行采集和数字存储,编写相应的软件对采集的数据进行数字图像处理的透射电镜数字图像处理系统。2.2中等分辨率数字成像设备2.2.1fpga成像/ip构成①ErlangshenES500W使用简单,能以接近TV的速度提供数字视频(DSV,DigitalStreamingVideo)图像,从而快速找到感兴趣区,只需一按鼠标就得到曝光参数自动优化的高分辩数字图像。视场比胶片更大,可即时回放拍摄的图像,存储图像,用户定制图像打印模板,是透射电镜在生物科学研究上取代胶片和暗室的理想选择。超级抗光晕性能使得记录强电子衍射图像变得容易,加上灵活的成像方式也适用于材料科学研究。②FastScan-F114是新一代CCD相机的代表。慢扫描CCD技术带来的是出色的图像质量,该机器还输出快帧率的视频信号。可选光纤1:1或光锥耦合,多种各样的机械设计适合几乎所有的透射电镜。FastScan-F114R安装在投影室中,与其它35mm广角接口安装的相机比较,虽然视角小了,但它失真更小、分辨率更高。软件为EMMENU,它在透射电镜图像的观察、采集、处理和分析,相机的控制,文件输入、输出等各方面都提供丰富且方便的功能。2.2.2种光纤耦合技术①TemCam-F214是透射电镜数字成像的一种万能的解决方案,适用于生物医学和材料科学研究。CCD芯片致冷到负25°C,光纤耦合采用了曲率矫正技术,优化的闪烁体设计为用户提供更多选择(高感光度HS和高分辨率HR)。软件为EMMENU。②与MultiScan系列的其他产品一样,MultiScanTM600HP每个部分的设计和制造都精益求精。闪烁体可选荧光粉型或YAG单晶型,超常的光纤耦合技术大大提高系统的灵敏度和分辨率。作为MultiScan系列中的精品,MultiScanTM600HP相机拥有专利性的紧凑型底部安装设计,工作电压达400kV,特别适合材料科学研究。多种软件包如DigitalMicro-graphTM等可选以充分发挥该机的优异硬件性能。2.3光学组件方面①UltraScanTM4000是第一种真正挑战胶片成像的数字成像产品,标志胶片在透射电镜图像记录中的应用即将结束,为透射电镜图像数字成像树立新的标杆。其最关键的部分,一是高对比度分辨率(HCRTM)的光学组件,由创新的高分辨率闪烁体和独特的光纤技术组成;二是采用具有高速多端口读出技术的最先进的CCD图像传感器。作为GATAN公司的顶级产品,UltraScanTM4000兼容GIF和ENFINATTM分析光谱仪等透镜附件,与DigitalMicrographTM软件完全集成。②TemCamF415/MP是第一个4K×4K的产品,其成像面积达61.4mm×61.4mm,这种尺寸在以前只有胶片能达到。EMMENU软件提供丰富的功能如图像剪裁、自动对焦、自动电子断层、三维图像重建等。它为材料和生物医学研究的所有应用以及低剂量应用和衍射成像提供完美解决方案。3讨论3.1cd成像设备的选择①侧装型产品以成像视野大、高每秒帧频率为其主要特点底装型产品则强调它们的高灵敏度、高分辨率成像。它们之所以有这些不同特点主要是因为它们所用的CCD图像传感器,以及与传感器配套的闪烁体、光学耦合装置等不同。侧装型产品所用的CCD尺寸较小,像素也较少、较小,动态范围也较小,因而信息量少,处理起来较快,所以可达到较高的每秒帧频率;而且侧装型产品挡住了电子线,无法在荧光屏成像,只有高帧率成像才能满足人们实时观察的需要。底装型产品所用的CCD都有较大的面积、较多和较大的像素,所以灵敏度高、成像的动态范围大、成像的分辩率高,自然信息量就大;还由于底装型产品安装于荧光屏底下,不影响通过荧光屏的观察,对动态成像可不作要求。在功能上,我们还可用数码摄像机和数码照相机来类比侧装型和底装型产品,它们分别适用于影像的实时动态和高分辨率静态记录。②关于视野我们以胶片的放大倍数为1,那么35mm接口处的放大倍数为0.2到0.3,(因透镜而异,我们取0.3)底部接口为1.1到1.5(也因透镜而异)。理论上,35mm接口处成像设备的视野是胶片的(1/0.3)2(约11)倍,但放大倍数只有胶片的0.3倍。如果一微小结构正好在胶片处成像能被辨别,此时同样的成像设备在35mm接口处根本就无法看清楚,要继续放大(1/0.3)约3.33倍才能被辨别。所以,侧装型产品的大视野是以牺牲透射电镜的放大倍数为代价的,因而也只适用于对放大倍数要求不高的生物学等方面的应用。其实,同样的成像设备,不管是侧装还是底装,在空间分辨率相同的条件下它们的视野是一样的。真正大视野应该是不损失放大倍数、不降低空间分辨率的视野,决定它的最重要因素是图像传感器的规格(面积和像素的大小)。③底装型产品往往采用较大规格的CCD、创新的闪烁体、更高级的光纤耦合技术、更先进的电子设计、严格的低温等,而侧装型产品对应的往往是较小的CCD、透镜耦合、普通电子设计、一般低温甚至室温,所以底装型产品往往有更高的灵敏度和分辨率,它们大多是中、高端产品;侧装型产品则多为入门级或普及型产品,。3.2透射电镜成像在透射电镜应用中,有的样品特别是生物样品不能耐受高强度、长时间的电子照射,于是人们追求更低电子辐射强度下的透射电镜成像即低剂量成像;同时,人们还进一步追求在同样电子辐射条件下获得更多的样品信息,即大面积高分辨率成像。在硬件性能上,透射电镜成像技术的发展就是对上述目标的不断追求。3.2.1成像方式的影响很早就有用电子管式影像增强器对电子进行增强,后来用带微通道板的影像增强器进行电子增强。不管哪种方式,它们的电子增益都可在一万倍以上,减去耦合等损耗,系统的电子增益至少在一千倍,因此电镜的电子辐射强度可降低至少三个数量级。现在很多数字成像设备也能通过像素合并的方式增加灵敏度,进行低剂量成像。比如一种2K×2K的CCD图像传感器,像素规格为14μm。当它以8倍并位工作时,它的像素为112μm,理论上灵敏度是原来的64倍,但这时的成像像素只有256×256。所以这种低剂量成像是以牺牲空间分辩率为代价的。而且其灵敏度还根本不能与影像增强方式相提并论。以目前医疗市场上用于X线动态成像的平板影像增强器为例,其像素大小从200μm到400μm不等,它们的主要指标DQE(量子检测效率)已经高于真空影像增强器。但从使用者那里我们很容易得到这样的反馈:真空影像增强器仍然比平板影像增强器有更高的灵敏度,而且在辐射剂量相同条件下,真空影像增强器有比平板影像增强器更好的动态成像效果。何况在透射电镜成像设备中,还没见哪款产品以合并出大于200μm的像素进行成像。因此,真正的低剂量透射电镜成像目前而且在相当一段时间内还将只有用影像增强器才能实现。3.2.2胶片成像基础目前透射电镜成像中,CCD图像传感器的最大面积是61.4mm×61.4mm,像素大小为15μm,总像素为16百万个。以胶片的最低空间分辩率为100线每毫米计算,同等面积的胶片所等效的像素为37百万个,是CCD图像传感器的两倍多。半导体图像传感器要在空间分辨率上真正超过胶片还有待时日。但在实际应用上,胶片虽然蕴涵了极大量的信息,利用率却很低。如果胶片按1∶1倍数印出正片,因