玉米转基因技术的研究进展

玉米转基因技术的研究进展

玉米不仅是重要的粮食和饲料材料，也是现代工业的重要原料。随着畜牧业、工业的发展以及世界人口的增长,玉米在农业生产中占有越来越重要的地位,1998年以来,玉米已超过水稻和小麦成为全球第一大作物。建国以来,我国玉米播种面积、单产和总产量都呈持续增长趋势,2002年我国玉米播种面积超过小麦而仅次于水稻,玉米单产由1123.1kg/hm2增加到5394.0kg/hm2,超过世界玉米平均单产水平,2006年玉米总产量达到1.45亿t,但与美国等玉米生产大国还存在较大差距。据相关研究推测,到2020年世界玉米需求量将达到7.53亿t,届时中国玉米需求量为2.14亿t。因此,玉米总需求量的不断攀升使得玉米生产面临巨大挑战。转基因技术使优良的基因在动植物和微生物之间进行交流,弥补某些遗传资源的不足,丰富种质库。植物转基因技术研究首先在烟草上获得成功,随之在农业上取得了巨大进展。2008年全球商业化种植转基因作物主要涉及大豆、玉米、棉花和油菜等,总种植面积已达1.25亿hm2,与1996年产业化初始阶段的170万hm2相比增长了74倍,12年累计种植面积已超过8亿hm2。玉米转基因技术研究始于1986年,随着研究的深入,在降低转化受体依赖性、提高转化效率、提出新型转化方法等方面取得了重要的进展。本文概述了玉米转基因技术的研究现状及其在玉米遗传改良中的应用,展望了玉米转基因的研究方向。1玉米转化技术的研究现状1.1稳定基因的转化高效植物转化系统应具备以下几个特点:转化方法不受基因型限制,且便于操作;受体组织具有较强的分化和再生能力;构建适宜的植物表达载体;筛选方法高效、可靠,易获得稳定遗传的转化事件;转基因植株的分子和遗传特性要有稳定、高效的基因表达。植物转基因方法基本分为三大类:一是载体介导转化,如农杆菌法等;二是DNA直接导入转化,包括基因枪法、聚乙二醇(PEG)法、电激穿孔法、超声波介导法、碳化硅纤维介导法和显微注射法等;三是种质转化,主要是花粉管通道法和子房注射法。目前,玉米转基因方法主要有农杆菌介导法和基因枪法,此外还有花粉管通道法。1.1.1高效农杆菌诱导转化玉米系统土壤农杆菌中的根癌农杆菌和发根农杆菌均为革兰氏阴性菌,同属根瘤菌科,可以侵染双子叶植物和部分单子叶植物。农杆菌是一种自然的植物基因转化系统,能转移一些相对较大的DNA片段,具有操作简单、成本低和整合位点较稳定等优点。农杆菌介导遗传转化主要过程,如图1所示:农杆菌吸附在植物敏感细胞上;农杆菌Ti质粒上的Vir区域被激活;T-DNA切割和T-DNA复合物的形成;T-DNA复合物进入植物细胞;T-DNA整合到植物染色体上并表达。Grimsley等于1987～1989年报道了MSV(MaizestreakVirus)基因的根癌农杆菌可以感染玉米叶片,且生长点部位最易被感染,但没有证明病毒DNA整合入玉米的基因组;1991年,Gould等用农杆菌侵染玉米芽尖,得到转基因植株,为建立玉米高效农杆菌介导转化体系奠定了基础;1996年,Ishida等报道了用农杆菌侵染A188自交系幼胚的转化率为12%～30%;1999年,先锋公司Zhao等获得农杆菌转化玉米骨干自交系幼胚的专利。Ishida等和Hiei等也分别报道了利用农杆菌介导法转化获得转基因玉米植株,并证明外源基因能够稳定表达和遗传。然而,在农杆菌转化玉米体系中,表达载体类型、农杆菌浓度、受体的基因型、共培养时间、共培养温度和筛选方式等都会影响玉米的转化效率。目前,农杆菌介导玉米遗传转化研究主要集中于单基因转化,但玉米的许多性状是由多个基因控制的,因此利用新技术寻找更多有用基因,探索农杆菌介导玉米多基因转化以及无标记转化是当前研究的方向。1.1.2玉米植株的生长特性基因枪法由美国Cornell大学的Sanford等研究提出。1987年,Klein等首次将基因枪法应用于植物转基因研究,并于1989年第一次使用基因枪法转化玉米获得成功,Gordon-Kamm等用同样的方法获得可育的转基因玉米植株。近些年,随着基因枪转化法在玉米遗传转化中的不断发展和完善,转化效率得到明显提高。研究发现,在转化过程中加入氯化钙和亚精胺能提高核酸与微弹的结合力,选择合适的转基因表达载体及受体组织,优化基因枪轰击参数(轰击次数、轰击时金粉用量、轰击距离、DNA浓度、氦气压力和微弹速度等)可有效提高基因枪的转化效率。基因枪法具有受体广泛、不受基因型限制、便于操作等优点。但是基因枪法在轰击过程中容易导致骨架载体的插入、DNA断裂和多拷贝整合等。另外,外源基因是随机整合的,会造成外源基因在表达水平上存在一定的差异,甚至可能导致基因沉默。基因枪法已成功应用于玉米、水稻、小麦、棉花和大豆等许多农作物的品种改良上,并且该技术被用于瞬间表达研究和培育稳定的转基因植株等研究领域。1.1.3玉米叶片基因的转化花粉管通道法由我国学者周光宇等创立,其原理是植物授粉后,将外源DNA沿着花粉管渗入,经过珠心通道进入胚囊,转化卵细胞或受精细胞的早期胚胎细胞。花粉管通道法作为一种颇具特色的转基因技术,无需建立原生质体和愈伤组织培养体系,无基因型限制和易于实现大规模转化等优点,加之玉米是穗状花序,小花丛生,具有发达的有性繁殖系统,每穗结实粒多,花粉易于采集,体外存活时间长等有利因素,使得花粉管通道法具有便利的条件。Dowet等用花粉管通道法转化玉米叶斑病基因得到转基因植株。Ohta等将外源DNA溶液与花粉粒混合后立即授粉,获得了高频率的转化。Langridge等和Wang等也分别成功地将外源DNA导入到玉米植株中。研究发现花粉管通道法受DNA导入时间、DNA溶液浓度和抗除草剂筛选浓度等因素的影响。目前,花粉管通道法已应用于棉花、水稻、小麦、大豆和玉米等农作物的改良和育种工作。1.2玉米原生质体的基因表达玉米基因转化的成功首先依赖于建立良好的受体系统,玉米转基因的有效受体主要包括四种:一是愈伤组织。外植体经过脱分化培养诱导出愈伤组织,再经过分化培养获得再生植株。外植体主要来自于玉米幼胚、成熟胚、分裂的玉米种子,幼穗或幼苗顶芽分生组织等;二是原生质体。由于有可行的物理或化学方法(如电击法和PEG法等)使外源DNA能有效地通过玉米裸露的原生质体膜,原生质体再生系统在上世纪80年代就大量用于玉米的转化,是最早用于玉米转基因的受体;三是种质。种质受体指玉米自身的生殖系统,如花粉粒或卵细胞,也称生殖细胞受体系统,主要应用在花粉管通道法和子房注射法。由于种质受体以生殖细胞直接作为受体细胞,外源基因导入后会随着正常的受精过程而得到稳定转化,因此,是很有潜力的受体系统;四是直接分化。直接分化指叶片、幼茎等外植体细胞越过脱分化产生愈伤组织而直接分化出不定芽获得再生植株。玉米茎尖是比较好的直接分化再生系统,Zhong等用茎尖培养产生了丛生不定芽,基因枪轰击得到了转化植株,特别是其建立了一种新的受基因型限制小的玉米丛生芽离体培养及转基因受体系统,能快速有效地获得大批转基因植株。巩健等和孙传波等分别以玉米茎尖为受体获得了转基因玉米植株,丰富了转化的受体基因型。1.3标记基因序列玉米转基因研究中使用高效表达载体对提高目的基因的转化效率和表达至关重要。用于玉米遗传转化的双元表达载体一般具有以下共同特点:(1)细菌的复制起始位点;(2)在原核生物中表达的选择标记基因;(3)多克隆位点;(4)植物细胞中表达的标记基因。转基因玉米研究中广泛使用的启动子有CaMV35S、Actin、Ubiquitin及组蛋白和非组蛋白染色体蛋白基因、核糖蛋白基因或其他“持家”基因的启动子以及玉米特异性启动子Globulinl。此外,考虑到转基因作物中标记基因的安全性,玉米转基因育种中标记基因的删除将成为研究热点,位点特异性重组系统之一的Cre/loxP系统是应用较多且较成熟的一个标记基因删除系统。研究表明植物病毒载体系统有三种:(1)单链RNA植物病毒载体系统;(2)单链植物DNA病毒载体系统;(3)双链DNA植物病毒载体系统,用这样重组的病毒载体感染植物细胞以获得外源基因的转移。病毒介导法载体比较小,便于在实验中操作,而且这类载体只要与植物细胞共培养就可以较高地感染植物细胞,外源基因能在植物细胞中快速复制和高水平表达,但是病毒载体应用于玉米遗传转化还有待深入研究。2冷反应、改造和转染玉米农艺性状1996～2009年全球转基因玉米种植面积占全球转基因作物总面积的百分比稳定增长(图2)。目前,转基因玉米农艺性状改良主要涉及抗除草剂、抗虫、抗病、抗旱和品质改良等,商业化种植面积较多的是抗除草剂、抗虫和二者复合性状转基因玉米(表1)。毫无疑问,转基因技术在玉米生产中将发挥越来越重要的作用。2.1抗机构生物基因制备抗除草剂转基因玉米是高效、低成本控制杂草的新途径。目前,国内已经利用转基因技术获得具有潜在利用价值的抗除草剂转基因玉米新材料(表2),其抗除草剂基因主要来源于细菌等微生物。国外已商业化种植了一批抗除草剂转基因玉米品种(表3),其中NK603已经在中国获得了30项专利保护(中国专利局数据库)。2.2抗虫基因检测虫害是造成玉米减产的主要因素之一,世界范围内玉米害虫达350多种,其中以蛀茎性和食叶性的欧洲玉米螟(ECB,Ostrinianubilalis)和亚洲玉米螟(ACB,O.furnacalis)最为严重。在玉米生产中通常使用化学农药来控制虫害,但也带来了一些负面问题:(1)玉米中有农药残留;(2)害虫逐步产生抗药性;(3)化学农药作用方式是非特异性的,杀死害虫的同时也使其天敌受害,从而危及多种生物资源。而抗虫转基因玉米能克服上述农药带来的不利因素。Schnepf等于1981年首次从苏云金芽孢杆菌克隆了一个编码杀虫晶体蛋白的Bt基因,该Bt蛋白与昆虫中肠柱状上皮细胞的刷状纹缘膜特异性结合,毒蛋白全部或部分嵌合于细胞膜中,导致细胞由于渗透平衡破坏而溶解,从而最终影响昆虫的存活、生长、发育和繁殖等。Bt蛋白的发现揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。1996年,美国已正式批准Bt基因玉米进入商品化生产,到目前已经商业化种植了多个抗虫转基因玉米品种(表3),其中MON810在中国已经获得了3项专利保护。目前,来源于微生物的抗虫基因是目前商业化应用最有效基因之一。近年来,研究人员在尝试克隆植物来源的抗虫转基因代替微生物来源基因,主要涉及的基因有:(1)蛋白酶抑制剂抗虫基因,如豇豆胰蛋白抑制剂基因(SCK)和豇豆胰蛋白抑制剂基因(CpTI)等。(2)植物外源凝集素(Lectin)基因,如雪花莲凝集素基因(GNA)和半夏凝集素基因(pta)等(表4)。另外,开发新型微生物来源的高效抗虫基因已成为目前研究的热点之一,如Cry系列的其他基因。2.3玉米抗性育种的研究玉米生长期间常受到病毒性病害(矮花叶病、玉米粗缩病等)、真菌性病害(玉米纹枯病)和细菌性病害等侵袭而使其品质及产量下降。常规育种由于抗原的缺乏和不同物种间的遗传隔离,使抗病育种工作受到了极大的限制,然而,研究抗病转基因玉米可以为玉米抗病育种提供新的种质(表5)。目前,玉米抗病转基因研究多为单个抗病基因的转化,挖掘新的抗病基因,利用转基因技术实现多抗病基因的聚合转化,培育多抗玉米材料将成为玉米抗病分子育种的发展趋势。2.4玉米相关基因我国水资源紧缺,干旱和半干旱耕地面积多,还有大片的盐渍土壤,因此,培育抗旱、耐盐转基因玉米新品种对提高作物的单位面积产量和扩大种植区域尤为重要。抗旱、耐盐转基因研究大体涉及以下几类基因:(1)编码渗透调节物质及逆境中保护细胞的基因,如超氧化物歧化酶基因(MnSOD)、海藻糖合成酶基因(TPS1)和胆碱脱氢酶基因(betA)等。(2)细胞膜上离子排运基因,如Na+/H+反向转运蛋白基因(NHX1)和液泡膜上焦磷酸酶基因(PPase)和TsVP基因等。Li等将TsVP基因转入玉米自交系掖478,结果表明可以提高玉米的耐旱性。(3)抗逆相关的调控基因,如DREB基因和TsCBF1基因等(表6)。目前,孟山都公司宣布其研究开发的抗旱转基因玉米已经进入实用阶段,预计将于2010年以后投入市场。2.5玉米基因的改良随着人们生活水平的不断提高和膳食结构的改变,玉米品质改良显得尤为重要。此外,玉米作为饲料和主要工业原料使得特用玉米品质改良逐渐成为关注的焦点。因此,利用转基因技术将外源基因或人工合成的高蛋白基因导入玉米来改良玉米的营养品质将成为研究热点。相关研究表明,玉米淀粉分支酶基因(sbe2a)、高赖氨酸蛋白质基因、O2基因、a-lactalbumin基因、cyMDH基因、植酸酶基因(phy)等已用来改良玉米品质。关淑艳等用花粉管通道法将sbe2a导入玉米自交系铁7922,提高了玉米胚乳中直链淀粉的含量。Bicar等用基因枪法将a-lactalbumin基因导入玉米自交系HiII,提高了玉米胚乳中玉米醇溶蛋白的含量。丁明忠等利用花粉管通道法和减压渗透法将大豆总DNA导入玉米,筛选到8个高蛋白材料,玉米种子中蛋白质含量比对照提高20%。此外,将phy转入玉米可以降解其体内的磷酸,提高可利用无机磷的含量及其玉米的品质。另外,与水稻、小麦和大豆等作物相比,玉米转基因技术改良品质的研究仍处于初始阶段。Song等克隆了控制水稻粒重的数量性状基因GW2,其功能缺失或降低可以显著增加水稻谷粒的宽度、加快子粒灌浆速度来增加粒重。孟超敏等用基因枪法将赖氨酸合成关键酶基因DapA导入小麦可提高小麦的赖氨酸含量,实现品质改良。马建等研究了以大豆脂肪氧化酶基因(Lx1、Lx2、Lx3)为靶基因,利用RNA干扰技术抑制其表达,降低大豆子粒中脂肪氧化酶活性及含量,创制了优良大豆种质新资源。因此,借鉴这些作物同源基因的研究对今后玉米转基因研究将起到推动作用。2.6基因型与分子鉴定玉米转基因研究还涉及雄性不育和生物反应器等方面。Mariani等将来自烟草花药绒毡层特异启动子TA29与核酸酶基因Barnase融合后转化玉米并成功获得雄性不育植株。Gadab等用基因枪法将纤维素1,4-D-葡聚糖内切酶基因转入玉米自交系HiII使其能够“生产”出具有生物活性纤维素酶,为实现绿色生物反应器生产廉价和高质量的纤维素酶成为可能。3针对玉米育种研究的问题和现状3.1水稻基因组的整合玉米转基因研究的下一个目标是发展更有效的技术以高效地转移并同时表达多个外源基因。有研究表明,通过农杆菌介导法成功地将相关外源基因(psy,lcy,crtI)整合到水稻基因组中,培育出胚乳中富含β-胡萝卜素的转基因水稻品种,食用后可满足人体每天所需VA,由于其稻米外观颜色为黄色,也被称为“黄金米”。玉米中约有20个基因影响玉米花色素的产生,其中8个基因[r(包括Lc、Sn)、b、c1、pl、p、vpl、in1和pac1]的调节功能已得到鉴定。因此,发展玉米多基因转化和基因聚合技术改良玉米品质,使其具有复合性状是今后玉米分子育种的明显特点,目前国外复合性状转基因玉米发展最快的是抗虫性状和抗除草剂性状复合品种(表7)。3.2无选择标记的冷却剂选育转基因植物安全性问题涉及目的基因以及整合进植物基因组中的转化载体序列,而后者主要包含了筛选标记的安全性。玉米转基因载体常采用选择标记基因如抗生素或除草剂抗性基因,表达上述标记基因的转化细胞对相应的抗生素或除草剂产生抗性,但这些化学筛选剂会抑制转化细胞的生长和再生而降低转化率。近年来这些选择标记基因对生态系统和人类健康的影响已引起公众的关注。鉴于这些因素,培育无选择标记的转基因玉米植株已成为重要目标。从转基因玉米植株中剔除选择标记基因或无选择标记基因转化是目前获得无选择标记转基因植株的主要策略。从转基因植株中剔除选择标记基因常用的策略是通过位点特异性重组将选择标记基因切除,具体有Cre/loxP系统、共转化法、转座子系统和染色体内重组等方法。3.3基因打靶技术通过遗传转化将目的基因导入植物基因组这一过程是个随机事件。由于目的基因在植物基因组中的位置效应其功能往往受到较大影响。基因打靶技术是在同源重组技术和胚胎干细胞(ES)技术基础上产生和发展起来的。基因定点重组技术是20世纪80年代后兴起的建立在基因同源重组技术和胚胎干细胞技术基础上的一种分子生物学技术。所谓基因打靶技术是将携带有选择标记的外源目的基因采用一定的方法导入受体细胞,再通过外源DNA序列与受体细胞染色体上同源DNA序列间发生重组,最终将外源DNA定点整合到受体细胞基因组某一确定的位点,或对某一预先确定的受体位点进行定点突变,导致受体细胞基因功能敲除或者点突变发生的技术。Paszkowski等首次将基因打靶技术应用于烟草转基因研究