氧化石墨烯的制备及其在生物传感器中的应用

氧化石墨烯的制备及其在生物传感器中的应用

石墨烯是一种碳原子紧密沉积在二维办公厅结构上的新材料（见图1所示）。这种石墨晶体膜的厚度仅为0.34nm。它是设计其他碳材料（如零维碳、纳米碳管、三维石墨等）的基本单元。它具有良好的结晶性、导电性、完美的钠隧道效应、半晶态耗旋效应和不消失的电导率等性质。石墨是一种疏水性物质,与其相比,氧化石墨具有大量的羟基、羧基等基团,是一种亲水性物质。其层间距也比石墨的层间距更大。因此,人们常将石墨氧化生成氧化石墨来制备石墨烯和氧化石墨烯纳米材料,氧化石墨用肼还原后再剥离所形成的是石墨烯,而没有用肼还原就直接剥离所形成的便是氧化石墨烯。二者的差异主要表现是氧化石墨烯表面均匀的分布着大量的-COOH和-OH,而石墨烯只在特定的地方分布有-COOH和-OH。氧化石墨常用的方法有:化学法、Standenmaier法、Brodie法、Hummers和Offeman法等。而氧化石墨经过适当的方法如机械方法、热膨胀剥离法和超声波震动处理即可制得石墨烯。超声法极易在有机溶剂或者水溶液中分散成为均匀的单层氧化石墨烯溶液,这为制备大量的单层石墨烯提供了可能性。结合碳材料、纳米材料及碳纳米层材料的优点,石墨烯已被广泛用于制备修饰电极,其中包括碳纳米管、高纤维纳米孔碳材料等。基于石墨烯巨大的比表面积,增大了生物分子的固定量,使生物传感器具有更宽的线性范围,较低的检测下限,为构建各种生物传感器提出了一个比较好的平台。辣根过氧化酶(HorseradishPeroxide,HRP)是从植物辣根中提取的一种含有血红素的过氧化物酶,含有6条多肽链和6个血红素辅基组成。辣根过氧化酶的主要功能是催化过氧化氢的还原反应。近些年,HRP已用于建造第三代生物传感器。HRP中的电活性中心与电极之间的电子传递速度很慢,因此研究酶的固定化材料和方法,使酶具有适宜的环境,保持其活性,具有良好的取向以加速电子传递过程是当前十分活跃的研究课题。本文采用Hummers和Offeman方法合成了氧化石墨,在蒸馏水中利用超声分散将氧化石墨剥片,从而合成了氧化石墨烯(GO)。然后将氧化石墨烯与辣根过氧化酶(HRP)、三角形貌的金纳米颗粒和壳聚糖混合后,固定到电极表面,构筑生物传感界面从而制成了辣根过氧化酶的第三代电化学生物传感器,用于过氧化氢的检测中。HRP酶传感器的响应灵敏度高,稳定性较好,结果令人满意。1实验部分1.1试剂和试剂厂CHI660D电化学工作站(中国上海辰华仪器有限公司)。透射电镜是由Philips,EM420型透射电镜透射所得。使用三电极体系,其中自制修饰电极为工作电极;饱和甘汞电极为参比电极;铂丝电极为对电极。辣根过氧化物酶(HRP,RZ>3.00,A>108.70U/mg)购于宝生物工程有限公司(大连);氯金酸(HAuCl4·4H2O,AR)购于昆明铂锐金属材料有限公司(昆明);H2O2(30.00%v/v水溶液)购于天津市大茂化学试剂厂(天津);H2O2消毒液(3.00%-3.50%)购于昆明南天化工药业有限公司(昆明)。石墨粉购于天津市风船化学试剂科技有限公司(天津)。壳聚糖(CHIT,Mw5×106-6×106,75-85%脱乙酰化)购于美国Sigma公司。用NaH2PO4和Na2HPO4·12H2O配0.20mol/L(pH7.0)磷酸盐缓冲溶液(PB)为测定的支持电解质溶液。硼氢化钠(NaBH496%)购于国药集团化学试剂有限公司。浓硫酸、五氧化二磷、焦硫酸钾、高锰酸钾、氯化钡、硝酸银、乙醇、硝酸、柠檬酸三钠等试剂均为分析纯,水均为二次蒸馏水。1.2聚乙烯醇pv的合成将25.00mL0.01%氯金酸水溶液、1.00mL30.00mmol/L柠檬酸三钠水溶液、1.50mL0.70mmol/L聚乙烯醇(PVP)与60.00μL30.00wt%过氧化氢混合在一起,在室温下搅拌混匀,然后快速将250μL0.10mol/L硼氢化钠加入到上述混合溶液里面,立即生成一种淡红色的胶体,30min后胶体变为酒红色。整个实验过程在暗处进行,制备好的胶体避光保存。1.3纳米氧化石墨烯的开发1.3.1预氧化得到一定的525目粒度45。m1.3.2采用心理反应时间将上一步晾干后的产物与460mL浓H2SO4置于三口烧瓶中,在0℃水浴中缓慢加入60gKMnO4,控制温度不能高于20℃。再向三口烧瓶中加入920mL蒸馏水,维持反应在35±3℃下进行2h。最后再加入2.8L蒸馏水和50mLH2O2,混合物由黄褐色变成亮黄色,约15min后终止反应。1.3.3在蒸馏过程中氧化石墨用250mL1:10的HCl溶液洗涤、过滤上述反应产物,以移除部分金属离子。把经稀盐酸洗涤后的氧化石墨装进透析袋中,在蒸馏水中进行透析,每2h更换一次蒸馏水,直至用BaCl2溶液检验滤液中无SO42-,且用AgNO3溶液检验无Cl-为止。然后将透析后的产物放入离心机中,在4000r.p.m.的速度下离心40min,移去少量未被氧化的天然石墨颗粒,得到的氧化石墨呈粘性、棕色胶体。在P2O5存在的条件下,于60℃真空干燥箱中真空干燥24h,密封保存待用。1.3.4超声功率的确定取一定量的氧化石墨分别分散在水,搅拌3h,然后在100W超声功率下超声3h,使氧化石墨片层剥落,获得棕色的分散液。在4000r.p.m.的速度下离心40min,移去离心沉淀物,即未剥落的氧化石墨,最终得到氧化石墨烯的分散液。1.4hrp/pr-aunps/go/cot混合涂膜的制备称取0.02g的壳聚糖,溶于4mL醋酸溶液(0.05mol/L)中得到0.5%(W/V)的壳聚糖醋酸溶液,然后再取25μL的壳聚糖溶液与25μL的氧化石墨烯分散液,混旋1h,再取出25μL的上述混合物与100μLprismAuNPs超声振荡15min,接着再取出5μL的混合物与10μL的辣根过氧化酶混旋10min,就制成了所需要的HRP/prismAuNPs/GO/CHIT混合涂膜溶液。1.5电极制备和改性将玻碳电极(φ=3mm)在金相砂纸上打磨,接着用Al2O3悬浊液将电极表面抛光成镜面,电极再依次放入硝酸(1:1)、乙醇、二次蒸馏水中各超声洗涤5min,晾干。在预处理好的电极上点上5μLHRP/prismAuNPs/GO/CHIT混合涂膜溶液,过夜。用二次蒸馏水清洗,电极不用时,置于冰箱中4℃保存。1.6电化学池h电化学实验在装有10mL支持电解质(PBpH7.0)的电化学反应池中进行。计时电流测定在-0.1V电位下进行,待背景电流稳定后,加入一定量的H2O2,记录响应电流值。2结果与讨论2.1石墨烯的微观形状为了考察石墨烯的微观结构,用透射电镜观察了氧化石墨烯的微观形貌特征。由透射电镜可看到氧化石墨烯呈薄片结构(见图2)。2.2金属丝的微观形态表达通过透射电镜观察了金三角的微观形貌特征。由透射电镜可以看出,所合成的金三角形态规整,呈三角形状。如图3所示。2.3-oh、-c-o利用KBr压片,用红外光谱仪进行测定,所得配合物红外光谱见图4:在3420cm-1左右为-OH峰,1733cm-1左右为-C=O峰,1380-1457cm-1左右为-C-H弯曲振动的峰,1080cm-1左右为-C-O-C-峰,2360cm-1为共轭-COOH峰,因为氧化石墨是黑色,透光率低,所以峰形较差。2.4用电极装饰电极的电流2.4.1扫描速度的影响图5比较了HRP/prismAuNPs/GO/CHIT/GC修饰电极在有无H2O2的磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中的循环伏安图。图中由a曲线可观察到背景电流。由b曲线可看出,当加入0.99mmol/LH2O2时,峰电流增加,证实了酶电极的对H2O2的催化作用。考察了扫描速度对峰电流的影响,当扫描速度从20到100mV/s变化时,传感器在含有0.99mmol/LH2O2的缓冲溶液中的循环伏安行为如图6。峰电流随着扫描速度的增大而增加。同时为了考察电流的特性,将峰电流对扫描速度的平方根作图(见内置图),从内置图可看出,峰电流与扫描速度的平方根成正比,说明此电流为扩散控制的电流。2.4.2纳米金纳米颗粒协同作用对过氧化氢活性的影响为了考察GO与纳米金三角的协同作用,分别制备HRP/GO/CHIT/GCE、HRP/prismAuNPs/GO/CHIT/GCE、HRP/prismAuNPs/CHIT/GCE和CHIT/GCE四种不同传感器。图7为不同传感器对过氧化氢的计时电流响应。从图7可以看出,HRP/prismAuNPs/GO/CHIT/GCE(b)的电流响应大于HRP/GO/CHITGCE(a)、HRP/prismAuNPs/CHIT/GCE(c)和CHIT/GCE(d)。结果表明了氧化石墨烯与三角形貌的纳米金颗粒的协同作用能增强HRP对H2O2的电流响应。首先,纳米金可作为细微的传导中心,能实现电极与HRP间的直接电子传递,并且纳米金具有较大的比表面积,能提供大量的活性位点吸附蛋白质分子,石墨烯巨大的比表面积也提高了酶的负载量。壳聚糖具有很好生物相容性和成膜性并能将纳米复合材料有效地粘着在电极表面,增加了传感器的稳定性和重现性。2.5实验条件的优化2.5.1电流直接下降考察了工作电位对电极响应电流的影响,结果见图8。在-0.5至+0.20V之间随着电位下降,电流急剧上升。为避免溶解氧,Fe3+等干扰物在负电位下的还原,本实验采用-0.10V作为工作电位。2.5.2缓冲液ph的影响在pH为5.89~8.49范围内,工作电位为-0.10V下,考察了缓冲液的pH对传感器的影响。结果见图9.。在pH为7.0时,电极响应最大。因此选择pH7.0为本实验的最佳pH。2.6酶电极活性检测在优化实验条件下,在0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中,逐次加入100μL0.1mol/LH2O2得计时电流曲线如图10。可见,酶电极对H2O2的浓度变化有快速灵敏的响应,响应时间为20秒,说明酶电极有优良的电催化行为。校正曲线如内置图,响应电流值随H2O2浓度升高而增大。当H2O2达到一定浓度时电流也达到饱和,说明此时酶的活性位点被底物饱和。测定H2O2溶液的浓度线性范围是1.48×10-5~2.99×10-2mol/L比黄要宽,检测下限为4.8×10-6mol/L比朱的过氧化氢传感器要要低。其中,回归方程为:i=459.2439C+0.1937;相关系数为γ=0.9859;在图中,i为响应电流(μA),C代表H2O2的浓度(mol/L)。2.7hrp酶电极重现性和寿命在含0.99mmol/LH2O2的0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中考察了HRP酶电极响应电流的重现性和寿命。用同一根电极3次连续测定,其相对标准偏差为1.5%,寿命为60天。2.8抗干扰性能为了考察电极的选择性,在所选择的测定条件,0.99mmol/LH2O2浓度下,加入不同浓度的草酸、酒石酸、水杨酸、丙氨酸、抗坏血酸、谷氨酸、柠檬酸、葡萄糖八种可能的干扰物质(见表),响应电流几乎无变化,这表明以上物质对酶电极响应电流都没有明显干扰,此传感器有优良的抗干扰性能。2.9消毒水检测为了考察酶电极的实用性,用其测定了市售消毒水(昆明某公司)的浓度,其测定结果与高锰酸钾氧化还原滴定法测定值基本一致(如下表),说明该电极可用于H2O2检测。3石墨的制备和生物传感器的应用将所合成的氧化石墨烯与三角形貌的金颗粒、辣根过氧化酶(HRP)和壳聚糖(CHIT)混合修饰到玻碳电极上制得过氧化氢传感器。石墨烯巨大的比表面积提