山大分子生物学 生物基地实验报告三

重组质粒的酶切以及PCR法鉴定1、判断各组的插入片段大小：各泳道的情况：1泳道为pUC19/HindⅢMarker，2、15、23泳道为λ-HindⅢMarker，16为DL5000Marker。结合上次实验对各组插入片段大小的初步判断、本次对重组质粒酶切电泳以及PCR的结果，对各组重组质粒插入片段大小的最终判断如下：（1）第1组、4组、5组第二轮、6组以及本组（3组）第二轮：插入片段大小为125bp。在酶切电泳图上可以看到这几个组酶切产物有两条较明显的的条带，上面一条位置基本与第1泳道pUC19/HindⅢMarker条带相当，可以判断其为质粒载体，下面一条条带比较暗，与DL5000Marker泳道相比，其位于100bp、250bp之间，可以判断其大小为125bp；另外，在PCR产物电泳图中可以看到这几个组重组质粒PCR产物最明亮的条带比DL5000中250bp的条带稍微靠上一点，即其大小稍大于250bp，由于空载体上下引物之间距离约为150bp，因此判断为单拷贝插入125bp片段。（2）第2组：插入片段大小为2322bp。酶切电泳图中可以看到酶切产物有两条条带，上面一条位置与第一泳道酶切空载体位置相当，下面条带与λ-HindMarker泳道的2322bp条带位置相当；并且上下两条带的亮度基本一致，再结合上次实验结果的判断，可以断定此组为单拷贝插入2322bp片段。（3）第3、7、10、11组：插入片段大小为2027bp。酶切电泳图中可以看到酶切产物有两条条带，上面一条位置与第一泳道酶切空载体位置相当，下面一条与λ-HindMarker泳道的2027bp条带位置相当；同样的上下两条带的亮度基本一致，再结合上次实验结果的判断，可以断定此组为单拷贝插入2027bp片段。（4）第8组：插入片段大小为6557bp。酶切电泳图中可以看到酶切产物有两条条带，下面一条位置与第一泳道酶切空载体位置相当，可以判断其为质粒载体，上面一条与λ-HindMarker泳道的6557bp条带位置相当；同样的上下两条带的亮度基本一致，再结合上次实验结果的判断，可以断定此组为单拷贝插入6557bp片段。（5）第9组：插入片段大小为23130bp。判断依据如上。（6）第12组：多拷贝插入2322bp片段和6557bp片段。酶切电泳图中可以看到酶切产物有三条条带，中间一条位置与第一泳道酶切空载体位置相当，可以判断其为质粒载体，最上面一条与λ-HindMarker泳道的6557bp条带位置相当，最下面一条与2322bp条带位置相当；再结合上次实验电泳结果——插入片段约为9kb，可以断定此组为多拷贝插入2322bp片段和6557bp片段。2、PCR电泳图分析：（1）各组的产物大小：从电泳图中可以看到第一轮中第1—4组以及第7—12组各组均有一条明亮的条带，其位置接近DL5000Marker的750bp条带，模板为插入564bpλDNA片段的重组质粒DNA，空载体上下引物距离约为150bp，PCR产物大小符合预期。并且没有非特异性条带的出现，由此可以判断对于该模板而言本次PCR比较成功。（2）图中看到第5、6组除了在750bp附近的条带，还有一条大小约为250bp的条带，出现这条带的原因可能是：这两个组各做了两组PCR反应体系，推测操作者在加完第一个体系的模板（插入125bp片段的重组质粒）后没有换枪尖，直接又在第二个体系中加第二种模板，在反应中有两种模板均得到扩增，因此电泳结果出现两条条带（3）图中还可以看到，第一轮各组所用模板一致，但各组条带的亮度却不一致，分析原因可能是：PCR反应体系中各种反应液（ddH2O除外）都是微量的，由于各操作者的操作不一致性以及移液枪的精确性差异都会导致制备的反应体系中各反应液量不一致，因此最终得到的目的条带的量会存在一定差异。另外，在电泳上样时，各组的上样量也会有微量差异。（4）图中可以看到，第二轮中各组的电泳结果很不理想，非特异性条带比较多。除了最下面那条比较亮的目的条带——大小约为250bp（稍大于250bp）外，还有3条非特异性的条带：其大小从上到下依次约为3000bp、2000bp、500bp。500bp这条非特异性条带出现的可能原因分析：①该PCR反应设定的延伸的温度和时间对于模板1（插入564bp片段的重组质粒）而言比较合适，可能对于相对较小的模板2（插入125bp片段的重组质粒）而言不是最合适的。②这些组使用的模板是上次实验各组提取的重组质粒DNA，不可避免的会掺杂微量的细菌染色体DNA，导致非特异性条带的扩增。由于四个组均出现相似的情况，基本可以排除操作中细菌或DNA污染反应体系这种可能性。（5）可以看到第二轮中本组(3组)PCR失败，没有出现目的条带，但在约2kb处出现一条很暗的杂带。分析原因：因为有杂带的出现，不可能是模板没有加到体系中，由于酶的加液量很小，所以很可能是Taq酶没有加到反应体系中。（6）可以看到第11组第二轮PCR产物电泳条带比较暗，但其位置与第一轮各组条带位置相当。很可能是因为其上样时，将样液点漂，导致条带很暗。3、在酶切电泳图1中可以看到，插入片段为125bp的各组的酶切产物电泳结果中，在空载体条带的下方都出现了一条很暗的条带，而且与对应的超螺旋质粒比较，该条带位置稍靠上。经分析，这条带应该是开环的重组质粒DNA。因为为使125bp条带能够在电泳图上显示出来，对插入125bp片段的重组质粒进行过量酶切，因此不可避免存在没有被酶切完全的质粒；假设其为线性质粒，与λ-HindⅢMarker相比，该条带大小约2kb，不符合实际，因此断定其为开环质粒DNA。4、上次实验报告结果判断中，我判断错了三个结果：第2、3、7、10、11组判断插入片段为2027bp或2322bp，没有给出确切的答案，实际为第2组插入片段大小为2322bp，第3、7、10、11组插入片段大小为2027bp；第9组判断为9416bp，实际为23130bp；第12组没有判断，实际应为多拷贝插入2322bp片段和6557bp片段。错误原因：①在判断第2、3、7、10、11组的结果时，只是利用超螺旋重组质粒条带与SupercoiledDNAMarker条带比较，而没有充分利用各组的线性带与DL5000DNAMarker和λ-HindⅢMarker进行比较。由于插入2322bp片段、2027bp片段的重组质粒其超螺旋电泳条带位置非常接近，在比较时不好判断是跑胶本身的偏移偏差还是相似条带大小不一带来的必然结果，因此还应该利用其线性条带进行进一步的判断。②第9组的判断错误原因：查阅资料得知，当重组质粒超过20kb时，很难转