育种技术实验

实验一花粉生命力测定目的在经过一段时间储藏的花粉或使用远地花粉时,则必须测定,便于杂交成果的分析与研究。通过实验，要求学生掌握花粉生命力测定的方法。药品及用具测微尺、显微镜、毛笔、载玻片、盖玻片、恒温箱、玻璃铅笔、蔗糖、蒸馏水、硼酸液、联苯胺、苯酚、酒精、碳酸钠、过氧化氢、琼脂。方法步骤方法可分三类：间接法、直接法、染色法。直接法原理将花粉直接在清洁的同种植物的柱头上，并且作好隔离工作，然后观察其雌花之发育，如果胚珠能够正常发育成种子，则说明花粉具有生命力，否则，就没有生命力。步骤第一步：将花粉直接授在清洁的同种另一植株花的柱头上，并作好隔离。隔1--3天采集已授过粉的柱头，固定于开水或F.A.A液中。第二步：染色剂的配置：配置1%苯胺兰溶液、配置0.5%苯胺兰乳酸酚。染色镜检花柱固定在开水中，并于水中煮烂，而后放在1%苯胺兰水溶液或0.5%苯胺兰乳酚中染色24小时,把花柱撕开,盖上盖玻片,用大姆指轻压。镜检,若花粉具有生命力,即可观察到花粉管伸入柱头组织,若花粉不具生命力,即无花粉管伸入柱头组织.间接法原理借人为创造的特定条件使花粉萌发，鉴定花粉生命力。硼酸液培养法配置10、50PPM的硼酸溶液。用毛笔取少量花粉播入已盛硼酸的清洁小瓶并加盖，放入恒温箱内培养。取出小瓶充分摇动均匀，用吸管吸一滴于载玻片凹槽内，迅速盖上盖玻片固定花粉粒，然后至于显微镜下观察。观察2-----4个载玻片，每凹面随机观察5个视野计算发芽率。染色法过氧化物酶测定法原理这是借助于测定花粉内过氧化氢酶活性强弱来确定花粉生命力的方法，在活的花粉内过氧化氢酶存在，它可以促进过氧化物放氧分解，这些刚被放出来的活性氧容易使还原剂氧化，在本实验中所用的无色的联苯胺和苯酚都是还原剂，但它们被氧化后确表现红色或玫瑰红色，如果花粉是活的，那么这个反应很快，则花粉都被染成红色或玫瑰红色，如果花粉是死的，则这一反应迟迟不能进行，花粉也就保持原色。步骤配置药液配置联苯胺溶液、碳酸钠溶液、过氧化氢溶液制片取少量花粉放在悬滴载玻片的凹点内，滴入一滴甲液，置片刻后，再滴一滴乙液，三分钟观察之。发芽率在显微镜下观察，凡表现红色或玫瑰红色的，都是有生命力的花粉，黄色的为没有生命力的花粉，计算方法同前。作业要求花粉生命力测定结果记载：花粉名称花粉采收保存方法显微镜倍数绘出花粉发芽形态图分析花粉发芽率高或低的原因。实验二室内切枝杂交目的种子小而成熟期短的某些树种可以从树上采下枝条在室内杂交。其好处是便于调整花期；操作、管理和观察记载均较方便。通过本实验，要求学生掌握杨树室内切枝杂交的基本方法。用具培养筒、枝剪、纸袋、标签、毛笔、扩大镜、花粉瓶、干燥器等。方法步骤1、选择杂交亲本（1）明确育种任务如选育速生、材质优良、抗旱、耐寒及耐盐碱。（2）制定杂交组合根据育种任务，确定参加杂交的树种及父、母本。（3）选择亲本植株选择生长健壮无病虫害的单株作为亲本。2、雌雄株、花芽与叶芽的识别杨树属树种都是雌雄异株，因此，在选择杂交亲本时，首先要作植株性别鉴定，同时还要区别叶芽或花芽。3、枝条的采集与修剪在已选好的母树上，从树冠中上部剪取直径粗1.5----2.0厘米，长70----100厘米左右并带有花芽的枝条，将采回的枝条，去掉徒长枝和叶芽，雄花枝保留全部花芽，以便收集大量花粉，雌花枝则根据枝条的粗细选留发育最好的花芽3----5个力求保留的花芽均匀地分布在枝条的中上部，其余的全部除去。在每个花枝上挂一标牌，注明树种名称、采条时间。雌花枝还应记出保留的花芽数。4、水培管理上述修剪好的枝条，在水中将基部剪成斜面，以增大枝条的吸水面积，然后插入装有清水的培养筒内。初期室内温度低，可隔一天换一次水。新换水应与原来的水温大致相同，枝条基部常有粘液泌出而影响水分的吸收，应在换水时将其洗去。如果枝条下端的切口已经变色甚至腐烂，则应在换水时，在水中剪去一小段。培养筒的沉淀物，应该经常洗刷。5、花期调节为了在雌花开放时有必备的花粉，应注意花期调节，以保证父本开花比母本早数天。如果父本与母本的花期相同，则应将花枝提早3-----5天放入温室。如果雄株花期较晚，则必须更早些培育雄花枝，或者把雌花枝置于阴凉潮湿处，以促使雄花比雌花先开。6、隔离为了达到杂交的预期目的，必须防止非父本的花粉落到母本的柱头上，为此，应在开花前进行隔离。隔离的方法很多，例如把不同杂交组合的枝条放在不同的房间，或者在雌花序上套袋隔离等。7、花粉采集、储藏和生命力测定8、授粉当雌花已经开放，柱头比较明亮，且有透明汁液时，即可授粉。授粉时用毛笔粘取少量花粉轻轻撒在柱头上，或用喷粉器喷到柱头上，授粉时毛笔不能触及柱头。授粉量不可过多或过少，过多容易吸干柱头液，不利于花粉发芽；过少则不能刺激柱头，也不利于受精。授粉后用扩大镜观察，花粉粒密布柱头上即可，同时注意一个花序的各个部分都要授到花粉。由于同一花序的各个小花盛开的时期不同，授粉工作应在连续进行2----3天，以每天上午为宜。授粉后应在标牌上注明父本树种、授粉日期、授粉人。9、授粉后的管理不同树种授粉后,约经3----5天柱头即开始枯萎,子房渐渐膨大,进入果实的发育期,在正常温度的条件下,从授粉到果实成熟,均需30----50天,毛白杨类30天左右,加杨类50天左右,小叶杨40天左右.授粉后要经常换水,洗刷枝条及培养筒,保持室内通风,把室温控制在20----22’c,不宜过高,湿度初期不低于85%,后期10、杂种种子的收获果实成熟期蒴果裂开并飞出带有绒毛的种子。为避免种子飞散，当蒴果由绿变黄即应套上小纱布或纸袋，待蒴果全部张开后取下袋子从绒毛中剥础种子，按组合分别贮藏，准备播种。作业要求：水培管理时要注意什么？隔离的具体方法有哪些？实验三染色体组型分析目的初步掌握植物染色体组型分析的基本方法。原理组型分析是对染色体组中的每个染色体进行测量、计算以及形态特征的描述。进行植物染色体组型分析，对于研究其起源、进化、种间的亲缘关系和种间杂种鉴定等都是重要的手段，是研究细胞遗传学、细胞形态学和细胞分类学的基本方法之一。用具及药品测微尺、显微镜、解剖针、载玻片、盖玻片、搪瓷盘、培养皿、染色皿、平底指管、三角瓶、恒温水浴、温度计、量筒、酒精灯、支架、石棉网、小滴瓶、吸水纸、橡皮头铅笔、染色液、对二氯苯、秋水仙碱、8----羟基喹啉、FAA液、盐酸。实验步骤用教师事先准备好的显微镜放大照片直接作组型分析。练习染色体标本的制备并进行组型分析。其步骤是：制备染色体标本（1）取材选较粗短的根，切取长约0.5厘米的根尖。取材的时间应事先经过反复试验，选分裂旺盛的材料，则有较好的分裂象。（2）预处理预处理的目的是抑制或破坏纺锤丝的形成。促使染色体缩短和分散。便于观察和计数。其方法有秋水仙素水溶液、对二氯苯饱和水溶液、8----羟基喹啉水溶液。（3）前低渗切取分裂旺盛部分根尖，放在0.075MKCl低渗液中，在20----25’（4）去壁倒去KCl溶液，加2.5%混合酶液在25----30’（5）后低渗倒去酶液，用蒸馏水慢慢冲洗2----3次，然后在蒸馏水中停留5---10分钟，进行低渗处理。（6）固定将低渗后的材料用甲醇：冰醋酸（3：1）固定液固定。（7）制备细胞悬浮液材料固定液中用镊子夹碎，制备细胞悬浮液。（8）去沉淀静止片刻，使大块组织沉淀，然后倒取上层细胞悬浮液。（9）去上清液将上层细胞悬浮液,静止20-----30分钟，已见细胞沉淀，用吸管吸去上层清夜，留约1毫升细胞悬浮液制备标本。（10）标本制备取一片预先在蒸馏水中冷冻的清洁载片，用滴管滴2---3滴细胞悬浮液于其上，立即将载片一端抬起，并轻轻吹气，使细胞分散，然后在酒精灯上微热烤干。（11）染色镜检干燥的片子用染色液染色，时间为15----20分钟，待染上色后，盖上盖片，用滤纸将载片上留下的染色痕迹擦净，即可镜简。2、组型分析(1)选材选取10个中期染色体分散良好的细胞,进行显微镜摄影取清晰底片放大出照片.或在放大机下精确描绘染色体的放大图象到绘图纸上.(2)测量与计算在显微镜下和放大照片上,对染色体依次进行测量和描绘.以微米记下绝对长度,同时计算出每条染色体的相对长度.(3)同源染色体的配对和编号根据对染色体实测结果进行同源染色体配对,并按染色体的长短进行编号排列.(4)按上述公式分别求出求出每条染色体的相对长度,臂比的数值,并标记出着丝点位置,列出染色体组型分析表。染色体编号实际长度(um)相对长度(%)臂比着丝点位置长臂(L)短臂(S)臂比r()(5)选择最好的分裂相照片，将编号配对的染色体剪下，按长短顺序贴于白纸上，着丝点应对齐在一条直线上，有随体的染色体排列在最后，并自定比例在坐标纸上绘出染色体组型模式图。作业要求：按顺序排列的染色体图在报告中间。简要说明着丝点位置，随体及其它有关形态问题。实验四花粉贮藏目的练习贮藏的基本方法。原理如果进行远距离杂交或亲本花期不遇，则应贮藏花粉，在贮藏期内以人为创造的低温、干燥、黑暗等条件，迫使花粉减低代谢强度，以延长其寿命。方法步骤将采来的花粉首先进行干燥，一般以花粉由相互粘结到极易分散为度。然后将其分装在指形管或小试管中，花粉不要太多，一般以五分之一管或更少为宜。管口用纱布塞好，管外贴上标签，注明树种、贮藏日期、贮藏方法及编号。然后放入以不同浓度的硫酸或无水氯化钙配置的一定湿度的干燥器里。最后把干燥器放在温度为0-----2’为了了解其生活力的变化可以每隔一定时间取出部分进行发芽试验以确定其生命，最后把结果编制成表格。表一在0’相对湿度%010253550657590硫酸浓度%9563.554.148.443.134.829.417.8附注在相同的温度条件下,无水氧化钙所控制的相对湿度改为32%。表二各种贮藏条件下花粉生活力保持情况的统计表贮藏条件发芽率%硫酸相对湿度（%）氧化钙控制相对湿度0255032月日注意事项花粉采集后应及时晾干，绝对避免高温。始终保持用具清洁以免孢子混入，引起发霉而影响花粉的生命力。每次取用花粉时动作要快，尽量不要使正在贮藏过程中的花粉遭受温度条件的剧烈变化。实验五观察减数分裂目的观察细胞减数分裂各个时期的特征；了解细胞中染色体的变化以及和遗传的关系；练习涂抹制片的方法。原理减数分裂是一种特殊的分裂方式，细胞连续分裂两次，染色体只分裂一次，这样形成的子代能保证染色体数目的恒定性。用具及药品显微镜、镊子、解剖针、载玻片、培养皿、酒精灯、量筒、吸水纸、滴管、固定液、醋酸洋红液、碳酸品红液。实验步骤用显微镜按次序直接观察减数分裂的永久封片。练习花粉母细胞涂抹制片方法并进行观察。步骤如下：将采集的史材置于固定液内固定2---24小时后，放入70%的酒精液中保存。取已固定好的试材排列在小培养皿中。剥开小孢子叶球或花蕾取出花药，放在载玻片上。用解剖针轻轻剥开花药，加一滴醋酸洋红染色，可在酒精灯上微微加热。除去药壁盖上剥片，再把片子放在吸水纸下，用拇指适力压下，使材料分开并把周围的染色液吸干。放在显微镜下观察分裂图象。上述压片所得的片子只是临时观察，如要长期保存，可按永久性制片的要求进行封片。仔细观看各个时期的主要特征。作业：绘出你所看到的分裂图象，并注明属于减数分裂的什么时期。说明减数分裂的过程，它和有丝分裂有何不同？实验六针叶树嫁接技术目的嫁接是树木无性繁殖的重要方法，是保存、繁育、推广良种的有效途径，通过学习，了解和掌握针叶树常用的嫁接技术和方法。用具和材料切接刀、芽接刀、劈接刀、锯子、枝剪、塑料薄膜带、单面刀片、标牌、钢卷尺、铅笔等。方法髓心形成层对接法接穗：切取长8----10厘米带有完整顶芽的侧枝为接穗，除保留顶端6---8束针叶外，其余的针叶全部去掉，用刀片先在接穗基部削一短斜面，然后在背面自顶芽下留有针叶处下斜切至髓心，接着顺髓心纵向平削去半边接穗，削面要平直光滑，一刀削成，接穗末端成扁契形。砧木：在主干较粗的一年升或二年生部位上，摘除接区全部针叶，然后两手持刀片手贴树干，从上向下通过韧皮部与木质部之间切开，露出乳白色的形成层，下端向里斜切一刀，以割断皮部使成尖齿状，其切面的长度与接穗削面长度一致。最后将接穗基部楔形部分对准砧木削面下部的尖齿状凹面中，逐步往下按压，将接穗切面贴在砧木削面上，使形成层相互密接，然后用塑料薄膜带自下而上缠绕，直到上端超过切口以后，再从上而下缠绕，到达下端后打一个活结。顶枝劈接法除去砧木嫩枝上部多余的针叶，保留中间的芽，劈开嫩枝顶端，取一年生的嫩枝做接穗，接穗长度5----8厘米，其直径尽量与砧木相当，接穗削成两个长斜切面，然后把接穗插进劈开的嫩枝顶端里，接穗与砧木的树皮必须对准，使两者形成层吻合，最后用塑料带绑扎。切接法接穗长5------8厘米，下部的针叶全部拔去，切两刀，一刀削出长3----4厘米的切面，在反面再斜切一刀，削成短切面，使接穗基部成楔形，在砧木嫁接处把皮层连同少量木质部削开，并于基部向下斜切一刀，使成楔形，砧木与接穗的切面必须吻合，二者形成层要能接合，最后用塑料薄膜绑扎紧。作业：检查各种嫁接方法的成活率，比较各种嫁接方法的优缺点，并写出实验报告。实验七杂种苗的培育和选择目的掌握杂种种子育苗及杂种植株特征的描述和选择方法。用具和材料木盆、镊子、钢尺、扩大镜、铅笔、记录板等，各种杂种种子、农药等。方法步骤一、播种育苗大粒杂种种子，可用一般的方法，在大田内播种育苗，小粒种子，由于数量少，比较珍贵，要求比较细致，一般采用盆播。播种盆的准备取沙壤土，加入适量肥料拌匀，经过消毒，然后装入盆中。土层厚15----20厘米，土表细平，播种前把花盆浸入水中，使水分慢慢从地下放渗入，直至表面完全浸润为止，最后筛一层消过毒的细土。播种杨树种子较小，生命力较短，采收后应及时播种，根据种子质量，按2x2厘米左右的距离，均匀地播入盆内，播后筛一层消过毒的土，厚度以种子似露非露为宜。幼苗期管理杨树种子发芽很快，在阳光充足，温度适宜的条件下，一昼夜即能长出幼根，2---4天全部发芽，由于幼根细嫩，所以早期对水分要求很严格，水分不能太多或太少，浇水方法最好是将花盆浸在水中，使水分上渗，如无条件浸水，可用喷雾器浇水，开始应少喷勤喷，每天至少喷一次，后期可减少次数，每次喷水量增大，喷水后应及时松土。幼苗出土后，应将花盆放在靠窗处比较明亮的地方，使之在阳光照射茁壮成长，几天后移出室外，早晚可经受阳光照射，逐渐锻炼其抗干旱的能力，中午则应酌情盖上帘子。杨树幼苗，容易发生立枯病，除事先土壤严格消毒外，培养过程中，还应经常注意观察，出现病情应立即防治。移苗幼苗长到4-----5厘米时，按一定株行距移入圃地，在此期间应注意适时灌水，松土，除草，防治病虫害，追肥等。二、杂种性状的分析苗木生长结束后，落叶前，应进行杂种性状的分析研究，根据形状特征的描述，研究其性状特点、抗性等，分成不同类型，为进一步选择提供材料。杂交性状分析尽可能与亲本对照比较，用对比的方法进行分析描述。不同类型可以选择典型植株进行观察及描述，内容如下：叶叶片的颜色、质地、形状、大小、叶缘、基部和先端、叶脉、腺点、复被物、叶柄形状和颜色、叶的着生角度等。茎颜色、园滑或有棱的形状、皮孔的形状和大小等。分枝多少、粗度、长短、枝角等。芽形状、大小、颜色、着生方式、有无复被物等。其他遭受病虫害的情况。进行杂种形状分析时，形态特征的描述应尽量准确，数量性状的描述，如叶片大小，可测其绝对值，也可以某一类型为标准，记载其相对大小，还可以按原来的形状大小绘制草图，质量性状可进行比较描述。杂种苗木的选择每木调查在杂种性状分析之后，即进行每木调查，测每一株的亘际直径及全高，如该组合内有不同类型存在，应分别调查。单株选择在杂种生长的第一年，根据每木调查结果，从每个组合中选出少量最符合选种目标的优良单株，剪取地上部分，单株扦插繁殖，而苗根则留在原地继续生长，第二年生长末期，根据这些优良单株实生苗两年的生长情况，以及材质、抗性等鉴定材料初步选出优良的原种单株，形成一个无形系，进一步扩大繁殖，以便进入品种比较试验。混合选择为了不致使优良的单株漏选，第一年生长期末在单株选择之后，再从剩余的苗木中选择基本符合选种目标的部分苗木混合扦插繁殖，形成混合无性系进入品种比较试验。单株及混合选择均未入选的苗木，同样于第一年冬季平茬，第二年仍继续观察其生长情况，如发现生长比第一年显著转好的，第二年再列入单株或混合选择的范围内，继续比较观察和扩大繁殖，其余的全部淘汰。作业要求：对于一个杂交组合的不同类型，分别进行分析描述，分析杂种形态属于何种遗传类型。选出一批杂种苗。实验八多倍体的鉴定目的熟悉和掌握多倍体鉴定的方法。用具及材料显微镜、镊子、解剖针、酒精灯、载玻片、盖玻片、秋水仙碱液、醋酸洋红、酒精、醋酸、盐酸、碘液、花粉、根尖等。方法步骤树木的组织经过秋水仙碱液处理后，是否已经变成了多倍体，需要通过