实训一 薄层色谱法对药片APC各组分的分析

实验一薄层色谱法对药片APC各组分的分析（4学时）一、实训目的1．了解薄层层析分离和鉴定有机物的原理和方法；

2.掌握薄层层析分离和鉴定有机物的操作步骤。二、实训原理薄层色谱是一种微量而快速的分离方法，它的原理是根据分析试样中各组分在不相混溶并做相对运动的两相——流动相和固定相中的溶解度不同或者在固定相上的物理吸附程度的不同，即在两相中的分配不同，而使各组分进行分离。薄层色谱法（TLC），系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，根据比移值（Rf）与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值（Rf）作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也用于跟踪反应进程。薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂）、薄层分配层析（纤维素）、薄层离子交换层析（离子交换剂）、薄层凝胶层析（分子筛凝胶）等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子（离子或原子）和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的Rf值（后面介绍Rf值）对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法加以定量。薄层层析有许多优点：它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，一般仅需15～20分钟；混合物易分离，分辨力一般比以往的纸层析高10～100倍，它既适用于只有0．01μg的样品分离，又能分离大于500mg的样品作制备用，而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。薄层层析的缺点是对生物高分子的分离效果不甚理想。薄层色谱法在\o"合成药物"合成药物和\o"天然药物"天然药物中的应用很广。有些文献和内容偏重于合成药物、化合物及其代谢产物，有些文献为在\o"中草药"中草药分析中的应用。每一类药物，例如\o"磺胺"磺胺、\o"巴比妥"巴比妥、\o"苯骈噻嗪"苯骈噻嗪、\o"甾体激素"甾体激素、\o"抗菌素"抗菌素、\o"生物碱"生物碱、\o"强心甙"强心甙、\o"黄酮"黄酮、\o"挥发油"挥发油和\o"萜"萜等，都包括几种或十几种化学结构和性质非常相似的化合物，可以在上述文献中找出一、二种全盘的展开剂，一次即能把每一类的多种化合物很好地分开。药物代谢产物的样品一般先经预处理后用薄层分析，应用也很广，但有时因含量甚微，不用采用气相和高效液相色谱法灵敏。APC为复方制剂，其组分为：“每片含阿司匹林（A）220mg、非那西丁（P）150mg和咖啡因(C)35mg”。化合物Rf值λmax熔点(°C)阿司匹林0.81276135-138非那西丁0.60249134-136咖啡因0.30273234-237三、实训器材乙酸乙酯、石油醚、氯仿、甲醇、丙酮、硅胶G、硅胶GF254、羧甲基纤维素钠水溶液（0.5～0.7%）、玻璃板、普通毛细管、薄层色谱展开缸、薄层色谱仪、研钵、量筒、烧杯、试管等硅胶GF—2542g，羧甲基纤维素钠，APC药片1片，二氯甲烷3mL，

展开剂：苯:乙醚:冰醋酸:甲醇=120:60:18:1短波紫外分析仪；鼓风干燥箱。

四、实训步骤

1、

薄层板的制备：

（1）玻璃片的选择与清洗：选择平整、光滑、透明度好、四边磨光、200χ20(mm)的长方形玻璃片。先用去污粉洗，然后依次用自来水、蒸馏水洗净。凉干。

（2）调浆与涂布：称取硅胶GF-2542g放入一小型研钵中，一边慢慢地研磨，一边慢慢地加水5mL。待调成均匀地糊状后（注意：动作要快），将浆液倾倒在洁净干燥的4块玻璃板上，用洁净的玻璃棒将浆液在玻璃板上大致摊匀，用手将带浆液的玻璃板在水平的桌面上作上下轻微的颤动，并不时转动方向，很快制成厚薄均匀、表面光洁平整的层析板。

（3）干燥与活化：将上述制成的湿层析板停放在一个水平且防尘的地方，让其自行阴干固化，表面呈白色。再放进烘箱中于110℃下活化1/2~1小时。稍冷，取出置于干燥器中待用。

2、点样

（1）样品液的制备：取药片APC一片在研钵中研细，然后转移到盛有二氯甲烷3mL的小烧杯中，经过充分搅拌，使固体物几乎全部溶解，将有机层转移到一个25mL的小锥形瓶中，用无水硫酸镁干燥，过滤，除去干燥剂后可直接用于点样。（已准备）

（2）点样：把以上制得的样品用毛细管点加到预制的层析板离板端1.0cm的起点线上，点样量不宜过多，一般在10-50mg，样品点不宜过大，控制直径在2-3mm。点样时只需用毛细管稍蘸一下样液，轻轻地在预定的位置上一触即可。点样后应使溶剂挥发至干后再开始下一步操作。

3、展开：将事先选好的展开剂放入展开缸内，展开剂液体的深度达1cm即可。马上盖好玻璃盖，使缸内达到蒸汽压饱和。放入点好样品的层析板，盖好瓶盖，使样品在缸内进行展开分离。当展开剂上升到预定的位置时，立即取出层析板，将它置于水平位置上风干，或者用吹风机吹干。

4、鉴定：将烘干的层析板放入254nm紫外分析仪中照射显色，可以清晰地看出展开得到的三个粉红色斑点，定出它们的相对位置。用尺子量出从三个斑点中心到起点的距离和展开剂从起点到终点的距离，测算出Rf值。Rf=化合物移动的距离/展开剂移动的距离。根据Rf值对照文献值可以确定APC药片的主要成分。

注意事项

1.所用玻璃板应洗净不挂水珠，光滑平整；调浆不宜过干或者过稀，否则，制版不均匀。

2.涂布厚薄一定要均匀，薄层的厚度约0.25mm，否则会影响分离的效果，并于室温下晾干后在110℃活化30分钟，置于有干燥剂的干燥箱或干燥器中备用。

3.点样用的毛细管必须专用，不得混用。点样时，使毛细管液面刚好接触到层析板即可，切勿点样过重而使薄层破坏。点样点一般为圆点，不能太大。五、实训思考1．薄层层析分离物质的原理是什么?

2．用Rf值为什么能鉴定未知物?3．薄层层析包括哪些操作步骤?附：1.薄层板制备除另有规定外，将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2～0.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干，后在110℃烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。常用吸附剂的基本情况：颗粒的大小，太大洗脱剂流速快分离效果不好，太细溶液流速太慢。一般说来吸附性强的颗粒稍大，吸附性弱的颗粒稍小。氧化铝一般在100-150目。氧化铝分为碱性氧化铝，适用于碳氢化合物、生物碱及碱性化合物的分离，一般适用于PH为9-10的环境。中性氧化铝适用于醛、酮、醌、酯等PH约为7.5的中性物质的分离。酸性氧化铝适用于PH4~4.5的酸性有机酸类的分离。氧化铝、硅胶根据活性分为五个级，一级活性最高，五级最低。黏合剂及添加剂：为了使固定相（吸附剂）牢固地附着在载板上以增加薄层的机械强度，有利于操作，需要时在吸附剂中加入合适的黏合剂：有时为了特殊的分离或检出需要，要在固定相中加入某些添加剂。薄层板的活化：硅胶板于105-110℃烘30分钟，氧化铝板于150-160℃烘4小时，可得活性的薄层板。2.点样除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边1.0-2.0cm，样点直径及点间距离同纸色谱法，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。点样直径不超过5mm，点样距离一般为1~1.5cm即可。样品在溶剂中的溶解度很大，原点将呈空心环---环形色谱效应。因此配制样品溶液时应选择对组分溶解度相对较小的溶剂。点样方式有点状点样和带状点样。3.展开展开剂也称溶剂系统，流动性或洗脱剂，是在平面色谱中用作流动相的液体。展开剂的主要任务是溶解被分离的物质，在吸附剂薄层上转移被分离物质，使个组分的Rf值在0.2~0.8之间并对被分离物质要有适当的选择性。作为展开剂的溶剂应满足以下要求：适当的纯度、适当的稳定性、低黏度、线性分配等温线、很低或很高的蒸气压一级尽可能低的毒性。以硅胶TLC片来说，洗脱剂的强度比较为：\o"全氟烷（页面不存在）"全氟烷(最弱)＜\o"己烷"己烷＜\o"戊烷"戊烷＜\o"四氟化碳"四氟化碳＜\o"苯"苯/\o"甲苯"甲苯＜\o"二氯甲烷"二氯甲烷＜\o"乙醚"乙醚＜\o"乙酸乙酯"乙酸乙酯＜\o"乙腈"乙腈＜\o"丙酮"丙酮＜\o"2-丙酮（页面不存在）"2-丙酮/\o"正丁醇"正丁醇＜\o"水"水＜\o"甲醇"甲醇＜\o"三乙胺"三乙胺＜\o"乙酸"乙酸＜\o"甲酸"甲酸(最强)。薄层展开展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按正文规定操作。将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，待展开至规定距离（一般为10～15cm），取出薄层板，晾干，按各品种项下的规