现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件

一、生物学的几个发展阶段简要回顾二、分子生物学的发展简史三、分子生物学的概念、原理、研究内容四、分子生物学取得的主要理论成就五、分子生物学取得的重要应用成就六、分子生物学的主要技术进步七、遗传的分子生物学八、基因工程现代生物学进展一、生物学的几个发展阶段简要回顾二、分子生物学的发展简史三、11、普通生物学阶段：以个体、群体、博物、描述为特征的生物学2、细胞生物学阶段：在细胞水平上揭示生命活动规律3、分子生物学阶段：在生物大分子水平上研究生命活动规律4、反向生物学阶段:由基因型到表型，由序列到功能的，与传统生物学研究思路反向而行的生物学，从理论上探讨生命的本质和生命运动的逻辑。一、生物学的几个发展阶段1、普通生物学阶段：以个体、群体、博物、描述为特2、细胞生物2二、分子生物学发展简史1944.Avery证明DNA为遗传物质（转化试验）1953.Waston&CrickDNA双螺旋结构1958.Crick提出遗传中心法则1961.Monas&Jacob乳糖操纵子模型1966.Neriberg等破译全部遗传密码1970.Arber等DNA限制性内切酶Khorana体外合成tRNA，发现连接酶Baltimore&Temin逆转录酶二、分子生物学发展简史1944.Avery证明DNA为遗传31972.Bergλ噬菌体与SV40DNA体外重组1973.Boyer&Cohen重组质粒表达成功1975.Southern发明杂交技术Bishop等发现第一个癌基因Src1977.Sanger.Maxman&Gilbert快速测序1978.Miniatis建立人类基因文库1981.Cech&Altman发现核酶1983.McClintock发现的跳跃基因获奖1984.Kohler单克隆抗体技术1985.Mullis首创PCR技术1972.Bergλ噬菌体与SV40DNA体外重组41990.人类基因组计划正式启动1993.Roberts&Sharp发现断裂基因Smith进行基因的定点突变1994.Gilman&BodbellG蛋白信号转导1995.Lewis等发现果蝇体节发育基因1997.Stanley发现朊病毒1999.Gunter.Blobel阐明胞内蛋白运输机理2000.Carlsson等神经多巴胺在信号转导中的作用2001.Hartwell等发现细胞周期调控因子CDK激酶等1990.人类基因组计划正式启动5三、分子生物学概念、原理、内容1、概念：

广义：所有生物大分子的结构、功能、重要性、规律性及相互关系狭义：分子遗传学2、内容：①生物大分子的结构与功能或①蛋白质的分子生物学②基因工程②核酸的分子生物学③基因表达调控③信号转导的分子生物学3、三条基本原理：

①所有生物体大分子的构成单位相同②大分子建成规则相同③生物体的特异性由其大分子的特异性所规定三、分子生物学概念、原理、内容1、概念：2、内容：3、三条基6四、主要的理论成就1、DNA双螺旋模板学说2、遗传中心法则3、基因表达调控理论（操纵子模型）4、基因学说的丰富和发展（基因现代概念的确立）5、基因突变理论6、基因作图理论7、分子进化学说8、信号转导学说9、细胞周期调控理论10、癌变的分子机制11、通用遗传密码字典与非通用遗传密码字典12、生物信息学13、基因组学与比较基因组学14、“RNA世界”假说15、细胞衰老和程序化死亡机理四、主要的理论成就1、DNA双螺旋模板学说9、细胞周期调控理7五、主要的应用成就（1）已用基因工程的技术研制出了一批珍贵的基因工程药物：①人生长抑素②生产胰岛素③生产生长激素④生产组织型血纤维蛋白溶酶原激活因子⑤抗血友病因子Ⅳ⑥制备乙型肝炎疫苗⑦生产多种细胞因子⑧制备基因工程抗体1、在医学上的应用成就五、主要的应用成就（1）已用基因工程的技术研制出了一批珍贵8现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件9（2）基因诊断与基因治疗①疾病诊断：遗传病、肿瘤、病毒感染的诊断，具有特异性高，适应性强的特点，常用方法有核酸杂交、RFLP、PCR、DNA指纹图谱②法医诊断、亲子鉴定③基因治疗：方法有将目的基因与逆转录病毒重组、转染受体细胞，使之表达以弥补缺陷；将目的基因对染色体进行定位整合，即基因打靶；裸DNA直接注射。（2）基因诊断与基因治疗10

至1997年，美国已批准上市的基因工程药物有近20种，它们是：胰岛素、人生长激素、干扰素、白细胞介素2、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、组织溶纤原激活剂、生长激素、促生长素、抗血友病因子Ⅷ、葡糖脑苷脂酶、脱氧核糖核酸酶、乙型肝炎疫苗、甲型肝炎疫苗、体内用单克隆抗体、鼠单克隆抗体。至1998年，我国已批准上市的基因工程药物亦有10余种，如：干扰素、白细胞介素、粒细胞集落刺激因子、链激酶、红细胞生成素、成纤维细胞生长因子等。至1997年，美国已批准上市的基因工程药物有近11基因工程方法生产蛋白质药物的优势是非常明显的基因工程方法生产蛋白质药物的优势是非常明显的12已投入使用（含临床试验）的基因工程疫苗已投入使用（含临床试验）的基因工程疫苗13现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件14①转基因植物：已克隆了100多个植物基因，使作物获得高产、优质、抗病、抗虫、抗逆等多种优良性状，下表列出了各国转基因作物的大田释放情况：转基因作物性状批准项数所占比例（%）抗除草剂129729.6抗虫104623.8优质88620.2抗病毒4369.9农学性状优2114.8抗真菌2084.7其它3036.92、在农业上的应用成就①转基因植物：已克隆了100多个植物基因，使作物获得高转基因15作物性状批准数马铃薯抗病、抗逆、品种5，1，1水稻抗虫、抗病、抗除草剂1，4，1棉花抗虫9玉米抗虫3大豆抗除草剂1小麦抗除草剂、品质1，1广藿香抗病1烟草抗病毒、抗虫2，2杨树抗虫1微生物提高固氮效率6我国获准进入大田的转基因植物（1998）作物性状批准数马16②转基因动物：相继培育成功的转基因动物包括，鼠、猪、羊、鸡、兔、鲤鱼、鲶鱼、金鱼等。③克隆动物：1997年，英国科学家克隆成功“多莉”绵羊（由成年乳腺细胞发育而来）和“波莉”绵羊，它的乳汁中含有人类基因的蛋白产物。④分子辅助育种：改选育性状为选育标记。.②转基因动物：相继培育成功的转基因动物包括，鼠、猪、③克隆动173、在能源开发和环保中的成就①利用超级工程菌以植物秸杆作材料生产有“绿色石油”之称的新型能源——酒精。②构建超级工程菌迅速清除海洋中的石油污染及其它环境污染。4、在采矿工业中的应用用工程菌浸矿，浸出铜、铀、钴、锰、锌、铝等金属加拿大用细菌浸出的铀已达230万吨。3、在能源开发和环保中的成就①利用超级工程菌以植物秸杆作材料18①人类基因组计划②水稻基因组计划③模式生物基因组研究：已阐明基因组序列的生物有19种（均为单细胞生物），此外小鼠、果蝇、家蚕、拟南芥等模式生物的基因组序列也将很快阐明。④建立了世界共享的三大分子数据库5、基因组学的重大进展①人类基因组计划5、基因组学的重大进展19六、技术进步1.超离技术2.电泳技术3.电镜技术4.X衍射与核磁共振5.分子杂交技术(Southern/Northern/Western/FISH)6.基因克隆、基因文库7.PCR8.DNA测序9.DNA化学合成10.载体构建11.染色体步查12.基因定点诱变13.基因打靶14.基因转移15.动物克隆六、技术进步1.超离技术8.DNA测序2016.单克隆抗体17.基因工程抗体18.基因诊断19.基因治疗20.基因作图21.差异显示22.分子进化工程23.分子辅助育种24.生物芯片25.DNA指纹26.酵母双杂交27.基因捕获28.RNAi29.基因敲除16.单克隆抗体23.分子辅助育种21ＰＣＲ法：

PCR（polymerasechainreaction)技术是Mullis于1986年发明的一项体外快速大量扩增ＤＮＡ片段的方法（获1994年诺贝尔奖）。其基本原理就是在体外模拟体内DNA复制的过程，在反应系统中加入欲被扩增的DNA片段，作为模板；人工合成的寡聚核苷酸，作为引物；耐热的DNA聚合酶（Taq）以及四种核苷酸三磷酸。反应时，先加热至约92℃，使模板变性。降温至约50℃使引物与模板结合（退火），加温至７２℃，在Taq酶作用下，使新ＤＮＡ链延伸。重复92℃（变性）、50℃（复性）、72℃（延伸）的过程使ＤＮＡ片段得到不断的扩增，可以重复几十个周期。ＤＮＡ片段将2n（ｎ为反应周期数）的倍数增加。ＰＣＲ法：22现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件23现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件24现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件25现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件26现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件27现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件28人类基因组计划1993-1998年的目标和截止到1998年10月全球定量完成的情况以及1998-2003年的新目标人类基因组计划1993-1998年的目标和截止到1998年129现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件30七、生物信息学简介研究内容：（1）各种生物数据库的建立和管理。这是一切生物信息学工作的基础，通常要有计算机科学背景的专业人员与生物学家密切合作。（2）数据库接口和检索工具的研制。数据库的内容来自万千生物学者的日积月累，最终又为生物学者们所用。但不能要求一般生物学工作者具有高深的计算机和网络知识，因此，必须发展查询数据库和向库里提供数据的方便接口。这是专业人员才能胜任的工作，通常在生物信息中心里进行。七、生物信息学简介研究内容：（1）各种生物数据库的建立和管理31（3）人类基因组计划的实施，配合大规模的DNA自动测序，对信息的采集和处理提出了空前的要求。从各种图谱的分析，大量序列片段的拼接组装，寻找基因和预测结构与功能，到数据和研究结果的视像化，无不需要高效率的算法和程序。研究新算法、发展方便适用的程序，是生物信息学的日常任务。（4）生物信息学最重要的任务，是从海量数据中提取新知识。这首先是从DNA序列中识别编码蛋白质的基因，以及调控基因表达的各种信号。其次，从基因组编码序列翻译出的蛋白质序列的数目急剧增加，根本不可能用实验方法一一确定它们的结构和功能。从已经积累的数据和知识出发，预测蛋白质的结构和功能，成为常规的研究任务。（5）DNA芯片和微阵列的发展，把一定组织或生物体内万千基因时空表达的研究提上日程．研究基因表达过程中的聚群关系，从中提取调控网络和代谢途径的知识，进而从整体上模拟细胞内的全部互相辅合的生化反应，在亚细胞层次理解生命活动。只有掌握已有数据、发展崭新算法，才能创造新的知识。这是生物信息学刚刚掀开的新篇章。（3）人类基因组计划的实施，配合大规模的DNA自动测序，对信322、在基因组计划中的作用1）高度自动化的实验数据的获得、加工和整理2）序列片段的拼接3）基因区域的预测4）基因功能预测5）分子进化的研究2、在基因组计划中的作用33遗传的分子生物学基因的化学基础是什么？遗传的染色体理论认为：基因位于细胞核内染色体上；染色体的主要化学成份——蛋白质和核酸何者为基因的化学基础？*“蛋白质是遗传物质”观点及其主要论据。基因化学本质的条件：具有三种功能(p31)。遗传功能(复制与世代传递)；表型功能(具有适当的控制性状的表达机制)；进化功能(能够产生变异满足生物进化的要求)。遗传的分子生物学基因的化学基础是什么？34三个学派E.Schrödinger(1945)(薛丁格)：Whatislife?二十世纪，由于物理学、化学和数学研究工作者的加入，在生物学与遗传学研究领域形成了三个学派：物理学——结构——结构学派；化学——生化——生化学派；数学——信息——信息学派。三个学派E.Schrödinger(1945)(薛丁格)：35第一节DNA作为主要遗传物质的证据一、DNA是遗传物质的间接证据二、DNA是遗传物质的直接证据(一)、细菌转化试验(二)、噬菌体侵染与繁殖试验(三)、烟草花叶病毒拆合实验*三、非核酸类的遗传物质第一节DNA作为主要遗传物质的证据一、DNA是遗传物质的36一、DNA是遗传物质的间接证据1.DNA含量的恒定性；2.DNA代谢的稳定性；3.基因突变与紫外线诱变波长的关系。一、DNA是遗传物质的间接证据1.DNA含量的恒定性；37(二)、噬菌体侵染与繁殖试验1.背景知识噬菌体侵染与繁殖基本过程：T2噬菌体浸染大肠杆菌后，遗传物质进入细菌细胞；利用大肠杆菌的遗传复制系统复制噬菌体遗传物质；利用大肠杆菌的遗传信息表达系统合成噬菌体组件；最后组装形成完整的T2噬菌体。因此只要弄清侵染时进入细菌的是噬菌体的哪一部分，就可能证明哪种物质是遗传信息的载体。另外：P是DNA的组成部分，但不存在于蛋白质中；S存在于蛋白质中，但DNA中没有。(二)、噬菌体侵染与繁殖试验1.背景知识382.Hershey和Chase的实验(p33)2.Hershey和Chase的实验(p33)39结果与结论试验结果表明：主要是由于DNA进入细胞内才产生完整的噬菌体；结论：DNA才是(噬菌体的)遗传物质。题外话：与Avery等人研究比较，本试验的精度低得多。但是由于放射性标记法(也称为示踪原子法)，当时为人们普遍采用；同时由于核酸研究及其它相关的成果，本试验结果很快得到人们的广泛认同。结果与结论试验结果表明：40(三)、烟草花叶病毒拆合试验烟草花叶病毒(TMV)是由RNA与蛋白质构成的管状微粒：中心是单链螺旋RNA、外部是蛋白质外壳。1.拆分感染试验：将TMV的RNA与蛋白质分离、提纯；分别接种烟叶，发现RNA能使烟叶致病，而蛋白质不能；用RNA酶处理RNA后接种烟叶也不能致病，表明RNA可能就是TMV的遗传物质。(三)、烟草花叶病毒拆合试验烟草花叶病毒(TMV)是由RN412.重组合试验Frankel-Conrat,Singer(1956)进行了图示试验：综上所述：到上世纪中期，多方面证据都直接或间接地表明DNA是主要的遗传物质，而在缺乏DNA的某些病毒中RNA就是遗传物质。2.重组合试验Frankel-Conrat,Singe42第二节核酸的化学结构与DNA复制*一、早期对核酸化学性质的研究二、DNA的一级结构三、DNA的二级结构*四、RNA的分子结构*五、DNA的复制第二节核酸的化学结构与DNA复制*一、早期对核酸化学性质的43*一、早期对核酸化学性质的研究虽然上世纪中才认识到DNA的生物学功能，核酸研究却已有一百多年历史：F.Mischer(1869)从外科绷带上脓细胞核中分离出一种不同于蛋白质的物质，含磷量高、并具有很强的酸性。他将这种物质称核质(素)(nuclein)；A.Kossel(1879)发现酵母等核质具有A、G、T、C四种碱基；R.Altamm(1889)将核素命名为核酸(nucleicacid)。Kossel(1901)又发现核酸中具有碳水化合物(糖)；P.A.T.Levene(1909)研究表明：酵母核酸含有五碳糖——核糖；Fisher(1914)人工合成核苷酸；P.A.T.Levene(1929)又发现动物胸腺细胞核酸含有脱氧核糖.Levene将前者命名为核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)，后者命名为脱氧核糖核酸(deoxy-ribonucleicacid,DNA)。并指出动、植物中均存在这两种核酸。*一、早期对核酸化学性质的研究虽然上世纪中才认识到DNA的生44二、核酸的一级结构关于碱基的种类、分子式、核苷酸的种类、结构等内容是生物化学中讨论的内容，请课后复习。在此谈三个关于核酸一级结构的内容：(一)、“四核苷酸”假说；(二)、查伽夫定则及其意义；*(三)、核苷酸序列及其测定。二、核酸的一级结构关于碱基的种类、分子式、核苷酸的种类、结45(一)、“四核苷酸”假说P.A.T.Levene(1930)提出“四核苷酸”假说，认为：核苷酸是核酸的基本组成单位；核酸是“磷酸—核糖(碱基)—磷酸”的核苷多聚体。四核苷酸假说奠定了核酸化学基础。但同时认为：核酸多聚体是由“四核苷酸结构”重复形成；每个四核苷酸结构包含四种碱基各一个；所以事实上认为在任何DNA中，四种碱基是等量的，DNA是四核苷酸结构的简单重复。这种观念影响了人们对核酸生物学功能的进一步认识。(一)、“四核苷酸”假说P.A.T.Levene(19346(二)、查伽夫定则及其意义E.Chargaff于1946-1950年根据纸层析、离子交换层析和紫外分光光度试验结果提出查伽夫定则：四种碱基的数量不是等量的；同一物种DNA碱基组成不变，而物种间则有很大不同；嘌呤碱基总量与嘧啶碱基的总量(克分子总量)相等(A+G=T+C)，且A=T、G=C。(二)、查伽夫定则及其意义E.Chargaff于1946-47*(三)、核苷酸序列及其测定查伽夫定则表明：核酸并不是四核苷酸结构的简单重复，核酸的碱基序列信息可能具有重要意义。以后的研究表明：碱基序列正是核酸生物学功能的基础，是遗传信息的内在形式。DNA及RNA分子序列分析技术也是最重要的分子遗传学研究技术：Sanger双脱氧法；Maxam&Gillbert化学法；基于化学法的DNA序列自动分析仪已成为常规实验设备。*(三)、核苷酸序列及其测定查伽夫定则表明：核酸并不是四核48三、DNA的二级结构*(一)、DNA分子结构的研究1.鲍林研究小组2.威尔金斯、富兰克林研究小组3.沃生、克里克研究小组(二)、DNA分子双螺旋结构模型1.DNA分子双螺旋结构模型要点2.DNA双螺旋结构模型的意义3.DNA分子构型的多态性三、DNA的二级结构*(一)、DNA分子结构的研究49*(一)、DNA分子结构的研究在“四核苷酸结构”理论的误导下，人们普遍认为核酸的组成、结构简单，可能不具有重要功能，一度忽略了对核酸的研究。上世纪中期，众多研究表明：核酸是遗传信息的载体，显然DNA的结构研究是进一步研究其功能和作用方式的基础。也由此激发了科学家从事核酸结构研究的兴趣，当时进行DNA结构研究的科学家很多，最重要有：*(一)、DNA分子结构的研究在“四核苷酸结构”理论的误导下501.鲍林研究小组主要工作：鲍林(Pauling)等1951年(提出蛋白质α-螺旋模型后)开始研究DNA分子结构。根据阿斯伯利Astbury等1938年获得的DNA分子晶体X射线衍射图像(显示DNA分子晶体呈螺旋结构)进行研究。提出DNA分子三链螺旋结构模型：引入多链、螺旋和氢链等概念。评价：虽然他们提出的模型并不正确，但是其研究方向和所采用的方法却为DNA分子结构模型研究确立了方向。注：1954年鲍林因研究物质聚合力而获得诺贝尔化学奖。1.鲍林研究小组主要工作：512.威尔金斯、富兰克林研究小组主要工作成就：Wilkins和Franklin改进了DNA分子晶体X射线衍射图谱技术；于1951年获得了更为清晰的图像；结果表明：

碱基位于螺旋内侧而磷酸基团在外侧，

同时测得了DNA螺旋的直径和螺距。2.威尔金斯、富兰克林研究小组主要工作成就：523.沃生、克里克研究小组Waston、Crick(1951-1953)：研究手段非常简单：用纸板等做磷酸、核糖和碱基模型，拼凑DNA分子的三维结构。理论知识深厚、富于创造性；视野广阔、收集信息全面并善于分析利用。3.沃生、克里克研究小组Waston、Crick(195533.沃生、克里克研究小组主要基于Chargaff、Pauling和Wilkins等三个方研究成果，Waston和Crick于1953年提出了他们的第三个DNA双螺旋结构模型。现在人们公认这是分子遗传学建立的标志。为此Waston，Crick和Wilkins于1962年获得了诺贝尔生理学及医学奖。3.沃生、克里克研究小组主要基于Chargaff、Pau541.DNA分子双螺旋结构模型要点1.DNA分子双螺旋结构模型要点552.DNA双螺旋结构模型的意义DNA双螺旋模型结构同时表明：DNA复制的明显方式——半保留复制。Waston和Crick在1953年就指出：DNA可以按碱基互补配对原则进行半保留复制。而在此之前对复制方式人们对一无所知。基因和多肽成线性对应的一个可能的理由：DNA核苷酸顺序规定该基因编码蛋白质的氨基酸顺序；DNA中的遗传信息就是碱基序列；并存在某种遗传密码(geneticcode)，将核苷酸序列译成蛋白质氨基酸顺序。在其后的几十年中，科学家们沿着这两条途径前进，探明了DNA复制、遗传信息表达与中心法则等内容。2.DNA双螺旋结构模型的意义DNA双螺旋模型结构同时表明563.DNA分子构型的多态性3.DNA分子构型的多态性57*四、RNA的分子结构*四、RNA的分子结构58*五、DNA的复制DNA复制的起点(单起始点与多起始点)；复制的方向(单向与双向)；复制的拓扑学；链的延伸(半不连续)；复制的终止；单链环状DNA的复制；复制的忠实性(准确性)；复制的酶学；复制的调控。*五、DNA的复制DNA复制的起点(单起始点与多起始点)；59半保留复制半保留复制60复制叉的结构复制叉的结构61*第三节遗传信息的表达与调控一、中心法则及其发展二、遗传信息的转录(RNA的合成)

与RNA的加工三、遗传密码及其特性四、遗传信息的翻译五、基因表达调控*第三节遗传信息的表达与调控一、中心法则及其发展62一、中心法则及其发展中心法则(centraldogma)阐述生物世代、个体以及从遗传物质到性状的遗传信息流向，即遗传信息在遗传物质复制、性状表现过程中的信息流向。最初由Crick提出，并经过了多次修正。一、中心法则及其发展中心法则(centraldogma)阐63中心法则的发展反转录(逆转录)：反转录酶；cDNA。RNA的自我复制。DNA指导蛋白质合成。中心法则的发展64三、遗传密码及其特性遗传密码的基本特性：三联性；非重叠性；连续性；简并性；有序性；通用性。三、遗传密码及其特性遗传密码的基本特性：65三、遗传密码及其特性起始密码子与终止密码子：起始密码子：

AUG(甲硫氨酸/甲酰甲硫氨酸)；终止密码子(无义密码子)：

UAA(赭石)、UAG(琥珀)、UGA(乳白)。通用性的另外情况：三、遗传密码及其特性起始密码子与终止密码子：66第四节基因的概念与发展一、经典遗传学中基因的概念二、生化遗传和早期分子遗传学对基因概念的发展三、基因的微细结构与性质四、现代分子遗传学关于基因的概念第四节基因的概念与发展一、经典遗传学中基因的概念67二、生化遗传学对基因概念的发展生化遗传及早期分子遗传研究在两个重要方面发展了基因的概念：基因是DNA分子上带有遗传信息的特定核苷酸序列区段，并且在染色体上位置固定、序列连续；遗传信息就存在于核苷酸(碱基)序列中。“一个基因一个酶”，基因表达为蛋白质；基因的核苷酸序列决定蛋白质氨基酸序列。二、生化遗传学对基因概念的发展生化遗传及早期分子遗传研究在68T4突变型(rII)遗传研究SeymourBenzer(1955)用E.Coli烈性噬菌体T4突变型遗传研究证明：拟等位基因的说法是不正确的。T4野生型在E.Coli菌苔上产生小而不规则噬菌斑。T4突变品系按表型可分为：rI、rII、rIII三类。其中rII在E.ColiB上产生快速溶菌现象，形成大而圆噬菌斑，在E.ColiK(λ)上不能生长。T4突变型(rII)遗传研究SeymourBenzer(169试验方法与结果试验方法：最初得到8个不同的rⅡ突变型品系，8个突变基因均定位于T4DNA的一个区段内(rII区段)；将8种突变型两两组合混和感染E.ColiB菌株(双重感染,doubleinfection)；从混和培养物中提取噬菌体颗粒感染E.coliK(λ)。试验结果：在菌苔上获得了许多小而粗糙的野生型噬菌斑。试验方法与结果试验方法：70双重感染试验双重感染试验71野生型的产生与基因内重组结果分析：回复突变的频率很小，不会产生如此高频率的野生型噬菌体(斑)；所以野生型只能由重组产生。用拟等位基因可以解释试验结果；但同时意味着：rII区段内至少存在8个拟等位基因。Benzer先后分离到400多个不同的rII突变。在rII区段内存在如此多的基因显然是不可能的。结论：这些基因并不是所谓的拟等位基因，而就是rII区段突变形成的复等位基因。基因是由更小的重组单位构成，野生型产生于基因内重组，从而推翻了经典遗传学基因不可分性的性质。野生型的产生与基因内重组结果分析：72*双重感染法绘制rII区段连锁图操作方法：用两种rII突变型双重感染B品系，收集溶菌液；分别接种到B品系、K(λ)品系菌苔上；考察两个品系菌苔上的噬菌斑数目，就可以计算两个突变位点间的重组值；绘制连锁遗传图。由于采用了条件致死选择系统(即在E.ColiK(λ)上rII不能生长)，分辨率极高，可以检测到十万分之一的重组值。*双重感染法绘制rII区段连锁图操作方法：73B品系双重感染的结果B品系双重感染的结果743.最小的结构单位重组值检测精度可达十万分之一，但实际结果不会低于0.01%；可推断基因内存在最小重组单位，本泽尔将最小重组单位定义为重组子(recon)。rII区段存在多种突变的结构表明：基因也并非最小突变单位。Benzer提出用突变子(muton)来描述基因突变的最小单位。理论上讲突变子不必等于重组子。但以后研究显示：突变子和重组子都是一个核苷酸对或者碱基对(bp)。所以基因内每个碱基均可能发生突变，任意两个碱基间均能发生交换重组。3.最小的结构单位重组值检测精度可达十万分之一，但实际结果751.双突变杂合体的互补作用假定有两个独立起源的隐性突变，具有类似的表型，如何判定是属于同一基因(功能单位)的突变还是分别属于两个基因(功能单位)的突变呢？在二倍体生物中，可以建立双突变杂合体。双突变体杂合体有两种形式，即顺式(cis)和反式(trans)，如图所示：1.双突变杂合体的互补作用假定有两个独立起源的隐性突变，具76顺反测验与顺反子根据两突变反式双杂合体有无互补作用可以判断它们是否为同一个功能单位的突变：突变型无互补作用为同一功能单位的突变；野生型有互补作用为不同功能单位的突变。这种测验称为互补测验，也称为顺反测验(cis-transtest)。Benzer将顺反测验所确定的最小遗传功能单位称为顺反子(cistron)，顺反子内发生的突变间不能互补。顺反测验与顺反子根据两突变反式双杂合体有无互补作用可以判断它77rII顺反测验rII区段突变的性质：rII突变具有共同性状，按经典遗传学理论，rII区段为一个基因；如果基因是最小的功能单位，它也是一个顺反子。Benzer通过顺反测验表明：100多个rII突变型可以分为A、B两组，组间突变型间能够突变，而组内的突变型间不能互补；与rII区段连锁图对照发现：两组突变分别位于rII区段的两端|A|B|。rII顺反测验rII区段突变的性质：78rII的两个顺反子经典遗传学意义上的一个基因(rII区段)实际上有两个顺反子(功能单位)。因此基因也很可能不是遗传的最小功能单位。有些基因具有一个顺反子，有些基因具有多个顺反子。在多顺反子情况下，基因是几个功能单位的复合体。Benzer提出“一个顺反子一条多肽链”。rII的两个顺反子经典遗传学意义上的一个基因(rII区段)实79四、现代分子遗传学关于基因的概念(一)、现代基因概念基因是DNA分子上带有遗传信息的特定核苷酸序列区段。基因由重组子、突变子序列构成的。重组子是DNA重组的最小可交换单位；突变子是产生突变的最小单位；重组子和突变子都是一个核苷酸对或碱基对(bp)。基因可以包含多个功能单位(顺反子)。四、现代分子遗传学关于基因的概念(一)、现代基因概念80(二)、基因的功能类型根据基因的原初功能可以将基因分为：1.编码蛋白质的基因，即有翻译产物的基因。如结构蛋白、酶等结构基因和产生调节蛋白的调节基因。2.没有翻译产物，不产生蛋白质的基因。转录产物RNA不翻译，如编码tRNA、rRNA。3.不转录的DNA区段。如启动基因、操纵基因。启动基因是转录时RNA多聚酶与DNA结合的部位。操纵基因是阻遏蛋白、激活蛋白与DNA结合的部位。(二)、基因的功能类型根据基因的原初功能可以将基因分为：81(三)、基因的几种特殊形式1.重复基因：指在染色体组上存在多份拷贝的基因。重复基因往往是生命活动中最基本、最重要的功能相关的基因。最典型的重复基因是rRNA、tRNA和组蛋白基因等。2.重叠基因：同一段DNA序列，由于阅读框架(转录范围)不同，同时成为两个或两个以上基因的组成部分。因此基因在染色体上可能有重叠，甚至一个基因完全存在于另一个基因内部。(三)、基因的几种特殊形式1.重复基因：823.断裂基因或隔裂基因生物遗传和早期分子遗传认为基因是一个连续的、完整的结构。1977年Doel研究表明：卵清蛋白基因中间存在不表达的碱基序列，表明基因的DNA序列可能是不连续的。外显子：参加蛋白质编码的DNA片段；内含子：不参加蛋白质编码的DNA片段。真核生物基因可能是不同外显子的组合——断裂基因。3.断裂基因或隔裂基因生物遗传和早期分子遗传认为基因是一834.跳跃基因(jumpinggene)又称为转座子(transposon)、转座因子、转位因子(transposableelement)。生化遗传和早期分子遗传学还认为基因在染色体上的相对位置是固定的。后来发现某些DNA序列可以在染色体上转变位置。转座子转位的过程也是一个遗传重组过程；转座子在染色体上转位可能会引起插入位置基因功能丧失(突变)，再次转位离开插入点时便会发生基因功能的恢复。4.跳跃基因(jumpinggene)又称为转座子(t84第五节基因突变的分子机制一、locus与site二、基因突变的类型三、DNA的防护机制四、DNA修复与突变的产生五、化学因素诱变的分子机制第五节基因突变的分子机制一、locus与site85一、locus与site经典遗传学认为：基因是染色体上的一个点，称位点(site)。现代基因概念认为：基因是DNA分子带有遗传信息的碱基序列区段；基因是由众多碱基对构成，此时将一个碱基对称为基因的一个位点(site)；而将基因在染色体上的位置则称为座位(locus)。一、locus与site经典遗传学认为：86二、基因突变的类型1.根据突变所引起的表型改变分为：形态突变型；生化突变型；致死突变型；条件致死突变型。2.根据基因结构的改变方式：碱基替换突变；碱基倒位；移码(插入与缺失)突变。二、基因突变的类型1.根据突变所引起的表型改变分为：87二、基因突变的类型3.从DNA碱基序列改变的多少：单点突变(替换)；

与经典遗传学的点突变pointmutation比较.多点突变(移码)。4.从突变所引起的遗传信息意义的改变：同义突变；错义突变；无义突变。二、基因突变的类型3.从DNA碱基序列改变的多少：88第六节遗传工程一、遗传工程概述*二、染色体工程*三、细胞工程四、基因工程第六节遗传工程一、遗传工程概述89一、遗传工程概述遗传研究要阐明遗传与变异的现象和基本规律，探索遗传与变异的原因及其物质基础。在此基础上：解释、研究生物进化的原因、过程和规律(遗传与进化)。改善动、植物和微生物的遗传特性——按照人类的意愿，创造、培育各种生物的新类型、新品种的人工进化过程(育种学)。育种工作的理论和技术水平在很大程度上取决于遗传学所取得的成就。讫今为止，动、植物育种的绝大部分成就都是以经典遗传、细胞遗传和数量遗传理论为基础所取得的。六、七十年代的绿色革命；育种工作面临的问题。一、遗传工程概述遗传研究要阐明遗传与变异的现象和基本规律，90一、遗传工程概述(一)、遗传工程的基础人类对自然改造的能力取决于对自然规律的认识水平。分子遗传、生物化学及分子生物学、细胞生物学的理论和技术发展使生物遗传操作的能力正在不断提高。遗传工程的理论与技术基础主要来自于：1.分子遗传学的理论；2.生物化学及分子生物学的成就；3.细胞生物学理论和技术。一、遗传工程概述(一)、遗传工程的基础91(二)、遗传工程的含义生物技术生物工程：遗传工程；蛋白质工程、酶工程；微生物工程；……遗传工程：在分子遗传理论、技术的基础上，通过工程设计与施工方式，从细胞、分子水平改造生物遗传特性。作为一个综合性的技术群体系，广义的遗传工程包含许多相关的组成部分，其主要的部分有三个：1.染色体工程；2.细胞工程；3.基因工程。狭义的遗传工程指的是基因工程。(二)、遗传工程的含义生物技术作为一个综合性的技术群体系，92*三、细胞工程细胞工程的主要技术和研究领域包括：细胞、原生质体的分离、培养；细胞、原生质体植株再生；体细胞无性系变异的诱导、筛选与应用；以细胞、原生质体作为基因工程受体；细胞、原生质体融合、杂种细胞筛选、鉴定与应用。*三、细胞工程细胞工程的主要技术和研究领域包括：93(一)、细胞、原生质体植株再生采用体细胞杂交在物种间进行遗传转移与应用的必要条件是：细胞、原生质体遗传全能性能充分实现，再生成新的生物个体。对植物而言，细胞和原生质体再生技术已经比较成熟。曾经是人们公认难题的禾本科植物原生质体再生在近二十多年来也已取得巨大进展。对动物而言，克隆羊“多利”的诞生表明：动物细胞(包括人体细胞)再生成为个体都是可能，其技术实现需要的仅仅是时间。(一)、细胞、原生质体植株再生采用体细胞杂交在物种间进行遗传94(二)、植物原生质体作为基因工程的受体最初常用的转基因受体有叶圆片、幼胚、愈伤组织等植物组织器官。在这些组织、器官中：细胞壁的存在会增加操作的难度；产生细胞嵌合体现象，难以筛选转化子。因此原生质体是最具潜力的植物基因工程受体，转化效率高、筛选方便。(二)、植物原生质体作为基因工程的受体最初常用的转基因受体有95(三)、细胞、原生质体融合采用细胞、原生质体融合产生杂种细胞，通过诱导再生获得杂种个体(双二倍体)，可避免有性杂交障碍。动物细胞不具有细胞壁，细胞融合技术较植物成熟和成功。当然动物细胞融合都局限于获得杂种细胞及其无性细胞系。可以预见：用杂种细胞核代替维尔·穆特获得克隆羊所采用的乳腺细胞核可以获得物种间杂种生物个体。人与小鼠杂种细胞的无性细胞系曾在人类基因染色体定位研究上发挥重要的作用。植物细胞融合由于细胞壁的存在而受到极大的限制。因此，去除细胞壁分离原生质体的技术是植物细胞杂交的基础。获得杂种细胞及其再生植株后，即可进行物种间细胞核、染色体以及细胞器的转移。(三)、细胞、原生质体融合采用细胞、原生质体融合产生杂种细胞96基因工程基因工程97现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件98所谓的遗传工程就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合。然后通过载体把重组ＤＮＡ分子引入受体细胞，使外源ＤＮＡ在受体细胞中进行复制和表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。所以基因工程（geneengineering）也称为遗传工程（geneticengineering）、基因操作（genemanipulation）、ＤＮＡ重组技术（recombinationDNAtechniques）。有时人们还称它为基因克隆（genecloning）或分子克隆（molecularcloning）。遗传工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制备，载体的选择，体外ＤＮＡ重组，重组ＤＮＡ引入受体细胞，克隆转化子的筛选，重组ＤＮＡ的检测等。所谓的遗传工程就是在分子水平上，用人工方法提99第一节基因工程的酶学基础一、限制性核酸内切酸（restrictionendonuclease）：这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶（restrictionenzyme）。限制性内切酶本来是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类：第一节基因工程的酶学基础100Ⅰ型酶：分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，所以在基因工程中应用不大。Ⅱ型酶：分子量较小（105Da），反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。Ⅲ型酶：这类酶可识别特定顺序，并在这一顺序的3’端24~26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的。Ⅰ型酶：分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸101现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件102现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件103同裂酶（isoschizomers)：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂、酶对甲基化位点的敏感性不同。同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。同裂酶（isoschizomers)：104限制性核酸内切酶的命名原则：第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoRI:来自于Escheriacoli

RY13的第一个限制酶。限制性核酸内切酶的命名原则：105二、末端转移酶（terminaltransferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它所催化的反应与DNApolI相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段为引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。

二、末端转移酶（terminaltransferase）106现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件107平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。

HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker108三、ＤＮＡ连接酶（DNAligase）该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。三、ＤＮＡ连接酶（DNAligase）109现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件110四、反转录酶（reversetranscriptase）这类酶来自于反转录病毒，它可以ＲＮＡ为模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。五、DNApolI及Klenow片段该酶常用于制备放射性比度比活体标记高得多的ＤＮＡ探针，探针的制备方法是采用所谓的缺口平移（nicktranslation）法制备的。该酶还用于裂口（gap）修补、反转录第二条链的合成（Klenow）、隐蔽末端的填平反应（Klenow）等。Klenow片段：DNApolI用枯草杆菌蛋白酶水解成两个片段，小片段（36KD）具有5’3’核酸外切酶活性，大片段（76KD）称为Klenow片段，具有DNA链聚合及3’5’核酸外切酶的活性。四、反转录酶（reversetranscriptase）111KlenowKlenow112第二节目的基因的制备一、化学合成法：1979年Khorana首先成功地合成了tRNA基因。在体外，可以合成一系列长约几百ｂｐ的寡聚核苷酸链，然后按照基因的顺序将这些短的核苷酸链连接起来。化学合成的不足之处在于：（１）要已知基因的核苷酸顺序；（２）基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百ｂｐ的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；（３）价格昂贵。第二节目的基因的制备113化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。同时，所合成的基因不含内含子。在原核生物中由于不能进行内含子剪接，所以一旦将含有内含子的基因引入原核生物中表达，其产物往往是没有活性的。由于化学合成法有上述一些优缺点，所以这种方法较多地用于合成一些比较小的基因，如某些激素基因。并也取得一些成功的例子，例如胰岛素基因，生长激素释放抑制激素基因等。由于技术的进步，目前已极少利用化学合成法制备目的基因，而是利用DNA的化学合成法合成一些短的DNA片段作为探针（probe）或PCR的引物。化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的114现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件115二、从cDNA文库或基因组文库中分离cDNA文库及基因组文库的构造我们将在后面讨论，如果制备好了cDNA文库或基因组文库，那么用原位杂交法来筛选（screening）所需要的目的基因所在的克隆子。将这一克隆子大量繁殖，提取ＤＮＡ，便可获得所需的目的基因。必要的时候还可以建立差示文库（differentiallibrary）。二、从cDNA文库或基因组文库中分离116现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件117现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件118三、ＰＣＲ法：PCR（polymerasechainreaction)技术是Mullis于1986年发明的一项体外快速大量扩增ＤＮＡ片段的方法（获1994年诺贝尔奖）。其基本原理就是在体外模拟体内DNA复制的过程，在反应系统中加入欲被扩增的DNA片段，作为模板；人工合成的寡聚核苷酸，作为引物；耐热的DNA聚合酶（Taq）以及四种核苷酸三磷酸。反应时，先加热至约92℃，使模板变性。降温至约50℃使引物与模板结合（退火），加温至７２℃，在Taq酶作用下，使新ＤＮＡ链延伸。重复92℃（变性）、50℃（复性）、72℃（延伸）的过程使ＤＮＡ片段得到不断的扩增，可以重复几十个周期。ＤＮＡ片段将2n（ｎ为反应周期数）的倍数增加。三、ＰＣＲ法：119四、mRNA差别显示分离目的基因根据表达特征，真核细胞的基因可以分为两类：一是所谓的看家基因（house-keepinggene），另一类是发育调控基因（developmentalregulatedgene）。在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物体对外界环境的压力的反应、在个体的衰老与死亡等不同的环境下发育调控基因的表达是不同的，这就是基因的差别表达（differentialexpression）。mRNA的差别显示技术就是用来分离这些差别表达的基因的一项有用的技术。该技术是P.Liang&A.D.Pardee1992年建立的，全称为mRNA差别显示PCR(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionchainreaction,DDRT-PCR)四、mRNA差别显示分离目的基因120原理：该技术是利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。3’端引物：利用mRNA的polyA尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，polyA尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：原理：该技术是利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。121根据这12种排列组合，设计12种不同的引物，这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由11~12个T及两个其它的碱基组成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。5’端引物：5’端为10个碱基（10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。用一种3’锚定引物和一种5’随机引物进行扩增，可获得50~100条100~500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5’随机引物。根据这12种排列组合，设计12种不同的引物，这样就将所有mR122现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件123第三节基因工程载体

载体（ｖｅｃｔｏｒ）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：

现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件124分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点。有适合的标记，易于选择。有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。125一、质粒（plasmid）载体质粒是一种独立于染色体外的小分子环状ＤＮＡ，一般大小约106~108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。一、质粒（plasmid）载体126以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。（4363bp）以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记127pUC系列：是目前最常用的E.coli质粒载体。包括pUC7、pUC8、pUC9、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119等。优点：分子量更小，拷贝数更高：分子量在3KB左右，拷贝数可达每细胞500~700个，因此不需要氯酶素扩增。引入多克隆位点（multiplecloningsites,MCS）方便操作。引入lacZ’基因方便筛选。pUC系列：128现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件129现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件130筛选原理——α互补——兰白筛选：LacZ’是lacZ基因的突变型，编码半乳糖苷酶N端的146个氨基酸（全长1201氨基酸）。MCS也在这个区域内。这类载体的适合宿主细胞必须是Z基因突变型，只具有Z基因C端的序列。当两个Z基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补，称α互补。具有α互补的细菌培养在含IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的培养基上会形成的兰色菌落。相反，不互补则产生白色的菌落。X-gal本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此菌落为兰色。如果在MCS位点上插入DNA片段导致插入突变，则不能产生α互补，因此菌落是白色的。IPTG起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。筛选原理——α互补——兰白筛选：131现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件132原核表达载体：pGEM系列包括pGEM-3、pGEM-3Z、pGEM-3Zf（-）、pGEM-4、pGEM-4Z等。带有噬菌体编码的RNA聚合酶启动子SP6及T7启动子，可用于外源基因的表达。原核表达载体：133现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件134pGEX系列：包括pGEX-1、pGEX-1λT、pGEX-2T、pGEX-3X等。该系列是一类融合表达载体，在克隆位点上游有一个谷胱甘肽巯基转移酶（glutathioneS-transferase，GST）基因的一个片段。融合位点上有特异蛋白酶水解位点，方便GST的去除。在GST上游有一个启动子Ptac（trp操纵子启动子与lac操纵子启动子的融合启动子），在IPTG诱导下表达。pGEX系列：135现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件136现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件137二、噬菌体（bacteriumphage,phage）载体：1、λ噬菌体载体：λ噬菌体的基因组结构：二、噬菌体（bacteriumphage,phage）载体138AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS头部基因尾部基因功能不明区溶原化重组早期控制阻遏DNA合成溶菌生长非必须区段cI基因：溶原过程控制基因，AWBCDEFZUVGHML139现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件140插入式载体：λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。由于λ噬菌体包装时，只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，所以插入式载体可携带的外源ＤＮＡ片段较取代式为小。

插入式载体：141现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件142cIEcoRILA32.7RA10.6λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16AcIEcoRILA32.7RA10.6143取代式载体：野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如Charon4A、λEMBL3/4、Charon40等载体，这些载体是用Lac5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的LacZ）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。取代式载体：野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是144Lac5EcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIMCSMCSCharon4AEMBL3/4Charon40Lac5EcoRI145（左右臂连接）（三段自身连接）（插入片段）（左右臂连接）（三段自身连接）146为避免载体自身连接产生的假阳性，可采用双酶解的方法。例如：λEMBL4EBSSBEEBSSBE

BSBSB欲克隆片B为避免载体自身连接产生的假阳性，可采用双酶解的方法。例如：147体外包装：

λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106~108/μgDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103~105/μgDNA。

λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5kb）的75%~105%。体外包装：1482、M13噬菌体载体：M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种单链ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。2、M13噬菌体载体：149M13噬菌体的特点：感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型ＤＮＡ（replicationformDNA,RFDNA）。可以象质粒ＤＮＡ那样在体外进行纯化和操作。成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RFDNA或ssDNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。噬菌体颗粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制约的，这一点正好与λ噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。M13噬菌体的特点：150现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件151RFDNARFDNA152现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件153三、质粒与噬菌体的重组载体：1、cosmid载体：也称粘粒、柯撕载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。三、质粒与噬菌体的重组载体：154现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件155现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件1562、噬菌粒载体：噬菌粒（phagemidorphasmid）是由单链噬菌体M13或f1与质粒载体重组而成的新型载体。它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。2、噬菌粒载体：157现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件158现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件159四、YAC载体与YAC文库：YAC（yeastartificialchromosome，酵母人工染色体）质粒载体是在人类基因组计划（HGP）实施的背景下发展起来的一类克隆特大片段的载体。这类载体含有酵母菌的复制起点ARS（automaticreplicationsequence,ARS），着丝粒CEN（centromere），端粒TEL（telomere），以及选择性标记和克隆位点；同时还含有大肠杆菌的复制起始点，可以在大肠杆菌中以环状质粒的形式存在。DNA体外重组后以原生质体转化的方式导入酵母细胞。这类载体克隆能力可达1~2Mb。主要用于基因组文库的构建。四、YAC载体与YAC文库：160现代生物学进展-现代分子生物学的若干主要进展资料课件161原核生物主要载体用途小结：载体用途质粒

λcosmidM13YAC大片段DNA克隆—++—+基因文库构建—++—+cDNA文库构建++———序列分析+——+—单链探针———+—工程菌+————原核生物主要载体用途小结：载体质162五、真核生物载体：由于真核生物与原核生物在ＤＮＡ复制和转录系统上存在着差异，所