第04章 临床酶学检验技术

第四章临床酶学检验技术温州医学院检验医学院沈财成全国高等医药院校医学检验专业规划教材

临床生物化学检验

（第二版）教学目标与要求——掌握1.酶活性的国际单位定义2.酶活性测定的连续监测法和定时法的概念3.连续监测法的计算和方法设计4.酶活性测定最适条件的概念和意义5.ALT、AST、ALP、GGT、LD、CK测定参考方法原理和评价2教学目标与要求——熟悉1.酶动力学参数的含义2.电泳法和免疫抑制法测定同工酶的原理3.AMY、CHE的测定原理3教学目标与要求——了解

1.酶蛋白质量测定的优点2.定时法测定临床常用诊断酶的原理和评价3.同工酶的其他检测方法4酶的概念：人卫第六版

酶（enzyme）是由活细胞合成的、对其特异底物起高效催化作用的蛋白质，是机体内催化各种代谢反应最主要的生物催化剂(biocatalyst)。人卫第七版

生物体内的酶（enzyme）是对其特异底物起高效催化作用的蛋白质和核糖核酸，前者是是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。概述5酶促反应表示为：

底物：Subestrate：S产物：Product：P酶：Enzyme：E概述6酶的化学本质：

绝大多数的酶是蛋白质，称这类酶为enzyme具有催化功能的RNA被称为核酶(ribozyme)具有催化功能的DNA被称为脱氧核酶(deoxyribozyme)概述7酶的研究历史：1926年J.B.Sumner首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点

1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂1995年，JackW.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性的DNA片段，称之为脱氧核酶(deoxyribozyme)概述8临床酶学

高诊断灵敏度高诊断特异性

临床酶学检验技术

酶活性测定酶蛋白质量测定概述9临床酶学的历史：

1908年Wohlgemuth用尿淀粉酶（AMY）诊断急性胰腺炎1930s，LPS、ALP、ACP开始用于临床——定时法1950s，Karmen、LaDue、Wroblewski等人建立了分光光度法，ALT、AST、CK、LD等酶活性测定应用于肝胆疾病、心脏疾病的诊断——连续监测法1970s，同工酶和酶蛋白质量测定1980s，同工酶亚型概述10目录酶学基本知识1血清酶变化的生理病理机制2酶含量的表示方法3酶催化活性浓度测定的理论基础4酶活性测定的影响因素与最适条件的确定5同工酶检测技术6目前常用诊断酶的酶活性测定7小结与展望8返回总目录11酶的结构和分类一酶的特性和应用二酶促反应动力学三第一节酶学基本知识12酶的结构和分类一辅因子（一）酶的组成单纯酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等结合酶酶蛋白（apoenzyme）（cofacter)辅酶（coenzyme)辅基(prostheticgroup)全酶(holoenzyme）=酶蛋白+辅因子全酶13酶的结构和分类一（二）酶的分子形式单体酶：只有单一的三级结构蛋白质构成寡聚酶：由两个以上具有三级结构的亚基聚合而成多酶复合体：由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体(oligomericenzyme)(multienzymesystem)（monomericenzyme)14乳酸脱氢酶同工酶115（三）酶的结构“非”必需基团必需基团结合基团：催化基团：活性中心：酶分子中直接和底物结合并起催化反应的空间局限（部位）酶的结构和分类一(Bindingsite)(Catalyticsite)决定酶的专一性决定酶所催化反应的性质（活性中心）16酶的结构和分类——结合基团一17酶的结构和分类——活性中心一牛胰蛋白酶

18酶的特性和应用二酶的特性（一）化学本质：除核酶、脱氧核酶以外，为蛋白质（二）高效催化性（三）高度特异性（四）可调节性（五）不稳定性19酶的特性——高效催化性二20反应总能量改变非催化反应活化能

酶促反应活化能

一般催化剂催化反应的活化能

能量

反应过程底物产物

酶促反应活化能的改变

酶的特性——高效催化性的机理二2122酶的特性——高效催化性的机理二collision

：碰撞

23酶的特性——高效催化性的机理二24酶的特性——高效催化性的机理二25一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种特性称为酶的特异性或专一性。

酶的特性——高度特异性(specificity)二26绝对特异性(absolutespecificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物

。相对特异性(relativespecificity)：作用于一类化合物或一种化学键。立体结构特异性(stereo

specificity)：作用于立体异构体中的一种。酶的特性——高度特异性(specificity)二27酶的特性——高度特异性(specificity)二µmol/L

28对酶生成与降解量的调节酶催化效率的调节通过改变底物浓度的调节广义上讲:多酶体系、关键酶（限速酶）酶的特性——可调节性二29酶促反应在温和条件下进行加热、过酸、过碱、重金属都可以使酶活性降低（失活）酶的特性——不稳定性二30●

改变

pH●

急速

加热

●

加入变性剂●

加入金属鳌合剂●

加入酶抑制剂抑制剂●

大量稀释TCABoilingSDSEDTAPMSF-----化学物理化学化学化学物理酶不稳定性——终止酶促反应的方法补充PMSF：Phenylmethanesulfonylfluoride，苯甲基磺酰氟，用于抑制蛋白酶

31

添加物

作用

一般使用浓度Tween-20,TritonX-100NaN3(sodiumazide)EDTAb-MercaptoethanolDithiothreitol(DTTorDTE)BSA(bovineserumalbumin)Glycerol,glucosePMSF,TPCK,TLCK,benzamidine

除去重金属

抑菌剂防冻剂蛋白酶抑制剂

表面活性剂

抗氧化剂

抗氧化剂

稳定剂

0.1～1mmol/L0.01%50%微量0.5～0.05%1～

10mmol/L1～

5mmol/L0.1～

10mg/mL酶不稳定性——缓冲液常用的添加物补充32添加物TLCK：对甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮TPCK：L-苯甲磺酰苯丙氨酰氯甲酮Benzamidine苄眯β-Mercaptoethanol：β-巯基乙醇Dithiothreitol(DTT)：二硫苏糖醇

补充33表4-1酶在医学检验中的应用举例主要特性应用技术举例化学本质是蛋白质高效催化性、高度特异性、反应条件温和催化剂反应前后没有变化形成中间络合物酶催化活性与酶量成正比高效催化性酶蛋白定量酶法测定代谢物固相酶技术抗体酶诊断酶学ELISACK-MB质量、前列腺特异抗原己糖激酶法测定血糖葡萄糖氧化酶膜电极测血糖抗病毒疫苗ALT、CKPOD、ALP

酶的特性和应用二34临床应用酶EC编号习惯用名英语缩写EC编号习惯用名英语缩写1.1.1.27乳酸脱氢酶LD、LDH2.7.3.2肌酸激酶CK、CPK1.1.1.37苹果酸脱氢酶MD、MDH3.1.1.3脂肪酶LPS1.1.1.41异柠檬酸脱氢酶ICD、ICDH3.1.1.8胆碱酯酶CHE1.1.1.496-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PDH3.1.3.1碱性磷酸酶ALP、AKP1.4.1.3谷氨酸脱氢酶GLD、GLDH3.1.3.2酸性磷酸酶ACP1.4.3.4单氨氧化酶MOD3.1.3.55'-核苷酸酶5'-NT2.1.3.3鸟氨酸氨甲酰基转移酶OCT3.2.1.1α-淀粉酶AMY、AMS2.3.2.2γ-谷氨酰基转移酶γ-GT、GGT3.2.1.30β-N-乙酰(基)-D氨基葡萄糖苷酶NAG2.4.1.1糖原磷酸化酶GP3.2.1.51α-L-岩藻糖苷酶α-FU、AFU2.5.1.18谷胱甘肽转移酶GST3.4.23.1亮氨酸氨基肽酶LAP2.6.1.1门冬氨酸氨基转移酶AST、GOT4.1.2.13果糖二磷酸醛缩酶ALD2.6.1.2丙氨酸氨基转移酶ALT、GPT酶的命名、分类及编号补充35酶促反应动力学（KineticsofEnzyme-CatalyzedReaction

）三（一）米氏方程（二）酶促反应进程（三）动力学参数（四）酶偶联反应36（一）米氏方程1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反映的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程。酶促反应动力学三3738（二）酶促反应进程1.延滞期是指酶促反应开始至达到最大反应速度所需要的时间2.线性期是指酶促反应速度保持恒定的时期，不受底物浓度的影响3.非线性期随着反应时间的延长，底物消耗越来越明显，酶促反应速度明显下降，偏离线性而进入非线性期酶促反应进程好似100m径赛酶促反应动力学三39图4-1酶促反应时间进程曲线酶促反应动力学三浓度(C)40（三）动力学参数1.初速度(initialvelocity)指在反应最初阶段底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度，用v0来表示2.最大反应速度(maximumvelocity)指当酶的结合位点与底物结合饱和时的反应速度，通常用V或Vmax来表示3.米氏常数（Michaelisconstant，Km）指酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位同底物浓度酶促反应动力学三41（四）酶偶联反应

Ex：待测酶

Ea：辅助酶Ei：指示酶

酶促反应动力学三42酶促反应动力学三图4-2IFCC推荐法测定ALT的时间进程曲线图4-2IFCC推荐法测定ALT的时间进程曲线43酶偶联反应进程1.预孵育期2.延滞期3.线性期4.非线性期酶促反应动力学三返回章目录44血清酶的来源与去路一血清酶变化的生理机制二血清酶变化的病理机制三第二节血清酶变化的生理病理机制45（一）按血清酶的来源分

1.血浆固有酶2.非血浆固有酶

①外分泌酶②细胞酶

注：除凝血酶和纤溶酶外，血清酶与血浆酶基本一致

（二）按诊断特异性分①非器官特异酶②器官特异酶血清酶的来源与去路一46（三）血清酶的去路

1.肾小球滤过从尿液中排出

2.网状内皮系统清除

3.血管内失活或灭活血清酶的来源与去路一471.性别2.年龄3.饮食4.运动5.妊娠血清酶变化的生理变异二481.酶合成异常2.细胞内酶的渗漏3.酶进入血液的方式4.其他血清酶变化的病理机制三返回章目录49酶活性浓度表示法一酶蛋白质量浓度表示法二第三节酶含量的表示方法50（一）酶活性单位

1.惯用单位2.国际单位：在特定条件下，1分钟能转化1微摩尔底物（µmol/min）的酶量为一个“国际单位”3.Katal单位：即每秒钟转化1个摩尔底物（mol/s）的酶量酶活性浓度表示法一

51（二）酶活性浓度指单位体积样品中的酶活性单位，习惯用U/L来表示体液中酶活性即酶活性浓度（三）正常上限升高倍数（upperlimitsofnormal,ULN)：是指用测得的酶活性结果除以参考范围上限

酶活性浓度表示法一

52以mg/Ｌ或µg/Ｌ来表示优点：①灵敏度高②特异性高③可测定无活性的酶④与酶活性测定一起，计算免疫比活性，可能提供新的资料和信息⑤在同工酶测定中更有价值酶蛋白质量浓度表示法二

返回章目录53定时法（Fixedtimeassay）

一连续监测法（Continuousmonitoringassay）二第四节酶催化活性浓度测定的理论基础54酶含量测定酶蛋白质量酶活性测定｛定时法连续监测法55（一）概念

将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，经过一定时间后，用终止液终止反应，通过化学或生物化学的方法测出底物或产物的总变化量，除以时间即可计算出底物消耗速度（－d[S]/min）或产物生成速度（d[P]/min），将速度换算为µmol/min便是以国际单位表示的酶活性。定时法一

56（二）计算

定时法一

57定时法无机P酚氨萘胺NAD(P)HH2O2酮酸淀粉ALT、AST、LDALP、ACP、5’NTALP、ACPADA、脲酶CK、GGTLD、GLD、G6PDALTAMS（三）定时法的方法设计显色物项目58（一）概念

将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，每隔一定时间（2s∼60s）连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率。

连续监测法二

5960连续监测法二61连续监测法二62连续监测法二（二）计算63连续监测法二64连续监测法色素原底物NAD(P)H系统过氧化物酶系统其他ALP、ALP、GGT、GPDA、AMS、AFULD、G6PD、HBDH、AD、SD、GLD、ALT、AST、CK、ADALPS、ADA、5’-NTCHE、ACP（三）连续监测法的方法设计65定时法连续监测法测总变化量，平均速度测速率终止酶促反应酶促反应一直进行多用化学方法检测多用酶偶联反应定时法与连续监测法的区别含延滞期或非线性期只计算线性期速度返回章目录66方法因素的影响

一测定条件的影响与最适条件的确定二第五节酶活性测定的影响因素与最适条件的确定其他因素对测定结果影响三67电位滴定法浊度法时间滴定法比色法分光光度法生物传感器荧光按监测手段各类终点法LPSNAD(P)HAMSCHENAD(P)HALT方法因素的影响

一68方法因素的影响

一终点法测产物测底物连续监测法按监测对象按监测速度方式｛｛69方法因素的影响

一样品启动逆向正向底物启动按反应方向按启动类型｛｛70

根据产物生成量或底物消耗量(C)与酶活性(v)、酶量（[E])、反应时间(t)成正比例的关系。如淀粉酶（碘淀粉显色原理）测定又可分为：

样品稀释法---------改变[E]

时间滴定法---------改变t

碘淀粉比色法-----改变v方法因素的影响

一71

1、产物生成类：根据产物生成量与酶活性、酶量、反应时间成正比例的关系，从无到有，从少到多进行测定，检测敏感度高。

2、底物消耗类：测定底物，从多到少，而底物消耗不明显，测定误差大，检测范围窄。如碘淀粉比色法。

方法因素的影响

一72

指反应所需的试剂先混合在一起，然后加入样品，依靠样品中的待测酶来启动酶促反应，只在延滞期去除部分干扰物，抗干扰能力等同单一试剂剂型，需要注意的是某些双试剂剂型是基于试剂稳定性考虑，并没有单独将底物作为第二试剂，也起不到消除内源性干扰的作用。

样品启动模式

方法因素的影响

一73指样品先与部分试剂（缺乏某个底物）预孵育一定时间，部分消除某些内源性、外源性干扰物以及杂酶的副反应，然后加入这个底物，启动待测酶酶促反应。需要双试剂剂型，IFCC推荐法多采用底物启动模式。底物启动模式

方法因素的影响

一74测定条件的影响与最适条件的确定二最适条件（optimumcondition）的概念：是指能满足酶发挥最大催化效率所需的条件。751.合适的底物和最适底物浓度2.理想的缓冲液种类和最适离子强度；反应液的最适pH3.最适反应温度4.合适的辅因子、激活剂浓度；酶偶联反应还需要确定指示酶和辅助酶的用量5.合理的测定时间，延滞期应尽量短暂并有足够的线性期6.合适的样品与反应试剂的比例；足够的检测范围7.尽量去除各种抑制剂测定条件的影响与最适条件的确定二76底物选择的原则是：①选择Km最小的底物②要有足够的溶解度③酶对底物特异性高④底物稳定性好⑤较高临床价值的底物

测定条件的影响与最适条件的确定二1.底物的确定77底物浓度的确定：①单底物酶促反应：选择[S]＝10Km～20Km，此时反应速度达到最大反应速度90.9%～95.2%

②双底物酶促反应：[A]/[B]之间的关系是一条双曲线，有无数组数据。采取最经济原则。F（一般选90%或95%）

测定条件的影响与最适条件的确定二1.底物的确定78缓冲液种类的选择原则：①尽量使用活性缓冲液②pKa与测定pH比较接近，有足够的缓冲容量

③纯度高，不含有抑制酶活性的杂质

④温度依数性小

⑤对酶有稳定作用

测定条件的影响与最适条件的确定二2.缓冲液的确定79缓冲液离子强度的确定：离子强度越高，电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，能满足缓冲容量的要求即可。①大多数酶活性测定的离子强度在0.1mmol/L左右②ALP用AMP缓冲液，离子强度达到0.9mmol/L，有磷酸基团接受体作用③GGT用高浓度的双甘肽有酰基接受体作用测定条件的影响与最适条件的确定二2.缓冲液的确定80测定条件的影响与最适条件的确定二81常用的缓冲液：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（HEPES）N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪（PIPES）三羟甲基氨基甲烷（Tris）二乙醇胺（DEA）三乙醇胺（TRA）2-甲基-2-氨基-1丙醇（AMP）

测定条件的影响与最适条件的确定二2.缓冲液的确定82在1986年以前IFCC推荐酶活性测定的温度是30℃2002年IFCC正式发表了“37℃下检测酶催化活性浓度的IFCC一级参考方法操作手册和参考制品认可系统”目前基本无异议，确定37℃为酶活性测定温度测定条件的影响与最适条件的确定二3.反应温度的确定83①脱辅基酶的酶活性恢复——预孵育期②EDTA——络合重金属离子③巯基酶需巯基试剂做激活剂反复实验法确定用量测定条件的影响与最适条件的确定二4.辅助因子、辅助酶的确定84①延滞期的确定原则是多观察几例浓度不等、病理情况不同的标本，选择延滞期最长者作为确定值。②线性期的确定线性期的确定与酶浓度的可测上限与非线性度有关。③计算非线性度，按最小二乘法的计算要求，读数次数应不少于4次，读数间隔按一般仪器要求30s就足够了，线性期在2min以上即可。测定条件的影响与最适条件的确定二5.反应时间的确定85样品量与反应液总量的比例与方法检测的灵敏度和检测上限有关，与测定误差也有关①样品/试剂越大可测上限越小，灵敏度越高，K值越小。1：10～1：100之间，1：30左右比较合适（CHE为特例，1：601）②改变样品/试剂是改变K值最简单的方法，K值一般确定在2000～5000之间③可测上限的确定与临床样品的分布和临床意义有关，有些仪器具有线性扩展功能测定条件的影响与最适条件的确定二6.样品/试剂、可测上限的确定86①最常见的抑制剂有产物的抑制、底物的抑制，分析器材或试剂中的重金属及体液中的药物等造成的抑制。②采取的措施：选用高纯度的原料、高纯净水、器材干净，在反应液中加入金属螯合剂，甚至可以引入一个副反应来去除产物的抑制作用等。测定条件的影响与最适条件的确定二7.抑制剂的去除87（一）仪器待测物的摩尔吸光系数与仪器波长的准确性、带宽、比色杯透光性有关。K值的设置还需考虑稀释体积、比色杯的光径、副波长等因素影响（二）校准物（三）实验参数（四）副反应的干扰其他因素的影响三88实测K值理论K值校准K值其他因素的影响三K值的校正89SPEt酶量合适的测定方法激活剂反应时间10～20Km缓冲液温度vo=Pt去除抑制剂底物返回章目录90电泳法一抑制法

二第六节同工酶检测技术其他方法三91同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的一组酶称为同工酶（isoezyme）凡酶蛋白结构不同的同工酶称为原级同工酶，而将经加工或修饰后的同工酶称为次级同工酶或酶多种形式

某些同工酶从组织进入体液后在蛋白酶作用下降解成不同的亚型（isoform）

同工酶及亚型的概念92原理：由于各型同工酶的一级结构或空间构象不同，形状也不同，因而带电性质不同，在电场中的电泳迁移率不同，使各型同工酶分离,然后用酶催化性质选择合适的显色系统使区带呈色评价：优点是选择合适的电泳条件可获得同工酶谱的全貌但缺点是其显色系统不可能是所有同工酶的最适条件，而且定量也比较困难只是一种半定量的方法酶与体内的白蛋白、免疫球蛋白等复合物形成“矫作物”电泳法一93常用的显色系统有：①重氮试剂染料：ALP、GGT同工酶的测定②电子传递染料：脱氢酶反应或脱氢酶偶联的指示反应产生NA