第05章 分子发光

第五章分子发光

—荧光、磷光和化学发光法分析化学（仪器分析部分）

分子发光

MolecularLuminescence分子荧光分子磷光化学发光生物发光散射光谱

光致发光：分子吸收了光能而被激发至较高能态，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光。化学发光：化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激发，在返回基态时发出光辐射。目录5-1荧光和磷光光谱法 5-1-1基本原理 5-1-2荧光分析仪器 5-1-3荧光分析方法的特点与应用 5-1-4磷光分析法5-2化学发光与生物发光分析法 5-2-1基本原理 5-2-2发光反应的类型与应用荧光（fluorescence）现象的第一次记录：1575年，西班牙内科医生和植物学家N.Monardes，观察到LignumNephriticum木头切片的水溶液呈现天蓝色。第一次被提议用于分析：1864年，Stokes第一次用于分析：1867年，Goppelsröder根据Al-桑色素配合物的荧光，建立了Al3+的荧光测定方法。GeorgeGabrielStokes(1819-1903)参考文献：

陈国珍，黄贤智，郑本梓，许金钩，王尊

本，荧光分析法，科学出版社，北京，1990JosephR.Lakowicz,PrincipleofFluorescenceSpectroscopy,KluwerAcademic/PlenumPublishers,NewYork,1999netLibrary电子图书基态单重态S激发态单重态S激发态三重态T 10-8s10-4-1s

5-1-1基本原理

5-1-1-1荧光和磷光的产生1．单重态和三重态

基态单重态(singletstate)：自旋电子成对,只有一种自旋方向↑↓,电子自旋总和是零，光谱项的多重性是1，以S0表示;当基态电子激发到某高能级时,将有两种激发态：即受激电子自旋相反与自旋平行:↑↓h、↑↑h。自旋平行多重性为M=2x1+1=3，称为激受三重态（tripletstate）用T表示，自旋相反多重性为1，称为激受单重态，用S表示；

激发单重态S与激发三重态T的不同点：⑷激发三重态的能量较激发单重态的能量低。⑶基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁；⑵tS=10-8s,tT=10-4～1s；⑴S是抗磁分子，T是顺磁分子；2．分子内的光物理过程辐射跃迁：荧光：S1最低振动能级—S0磷光：S——T非辐射跃迁：振动弛豫内转移外转移系间窜跃非辐射能量传递过程

振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。

内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。

外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间窜跃：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。辐射能量传递过程

荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态，多为S1→S0跃迁，发射波长为

‘2的荧光；10-7～10-9s。

由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；

‘2>

2>

1；

磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态，T1→S0跃迁；电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）

S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持续一段时间。5-1-1-2光谱曲线激发exmax 发射emmax 磷光（phosphorescence）特征：（1）Stokes位移（2）ex一般不影响emsp的形状（3）吸收光谱与emsp的镜像关系激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图

2,

1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如

‘2)。c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。镜像规则的解释

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。

5-1-1-3荧光的影响因素1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。 量子产率:

荧光物质发射光子数与吸收激发光子数之比（当非辐射跃迁A返回基态的概率很小时，

F接近于1，在通常情况下，

F总是小于1的）2．荧光与有机化合物的结构（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。3．荧光与金属螯合物(1)配体发光

荧光弱 荧光强(2)金属发光

Mn(II) d* d4．溶剂效应

同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强度可能有明显不同。一般情况下，随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π*跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移。5．温度的影响

一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低，荧光效率和荧光强度将增加，相反，温度升高荧光效率将下降。如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光效率增加3%，冷至-80℃时，荧光效率为100%。碰撞能量转移O2的作用(光漂白)自熄灭、自吸收

(内滤效应)6．荧光熄灭（猝灭）

Fluorescencespectra(

-)ofTPPandabsorptionspectra(---)ofETH5294inplasticizedPVCmembrane:a.ExcitationspectrumofTPP;b.EmissionspectrumofTPP;c.UnprotonatedETH5294;d.ProtonatedETH5294.

荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消失或荧光强度与浓度不呈现线性关系的现象。5-1-1-4荧光强度的定量关系

k与仪器有关的常数I0激发光的强度

F荧光量子产率

荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数l光程长度。

根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c之间的关系是：

当

cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均可忽略不计，Parker方程可简化为：

19世纪前

肉眼观察

1928年Jette，West发明光电比色计

1939年

应用光电倍增管（PMT）

1952年

商品化校正光谱仪器

1980年后

计算机化

5-1-2荧光分析仪器5-1-2-1荧光分析仪器框图光源激发单色器样品池发射单色器检测器信号处理显示I0FI15-1-2-2荧光分光光度计部件理想的荧光分析仪器?1．光源：钨灯、汞灯、氙灯、激光激发光源应具有稳定性好、强度大、适用波长范围宽等特点。其中稳定性：影响测定的重现性和精密度；强度：影响测定的灵敏度。2．单色器：滤光片、光栅激发单色器和发射单色器3．检测器 PMTPhotomultiplier CCDChargeCoupledDevice CIDChargeInjectedDevice

4．信号处理HITACHIFluorescenceSpectrophotometerF-4500FeaturesThreedimensionalcontourplotsPhosphorescence

Inadditiontofluorescenceandphosphorescencemeasurementsluminescenceisincludedasstandard.Theintense150wattxenonsourceprovidesmaximumlightenergyovertheentire200-900nmwavelengthrangeofthespectrophotometer.Ouruniquehorizontalbeamgeometryoftheexcitationandemissionbeamsincreasessensitivityandrequiresonly0.6mLofsampleinastandard10mmcuvette.灵敏度高：比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.1ug/cm-3 相对灵敏度：0.05-0.005ppb（0.05MH2SO4)选择性高重现性好取样量少仪器不复杂5-1-3荧光分析方法的特点及应用 1．特点

2．应用

检测：金属离子、有机物、生物分子生物分子相互作用研究疾病诊断（参见附件）

定性分析：依据不同结构的物质所发射的荧光波长不同；定量分析：同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系。5-1-4磷光分析法 1．如何获得较强的磷光增加试样的刚性: 低温冷冻固体磷光法： 吸附于固相载体（滤纸）分子缔合物的形成： 加入表面活性剂等重原子效应： 加入含重原子的物质，如银盐等敏化磷光： 通过能量转移产生磷光 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级 →基态，T1→S0跃迁；电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）2．磷光分析仪器

荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。液槽斩波片

测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶。3.应用稠环芳烃和石油产物 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表农药、生物碱、生长激素 烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析 检测限0.01ug/cm-3

药物分析 见表5-2化学与生物发光分析法

5-2-1基本原理1.化学发光反应（Chemiluminescence）在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A+B→C+D*D*→D+h

（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当

E=170～300kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；

化学发光反应如果存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光（bioluminescence）。2.化学发光效率化学效率：发光效率：时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：dc/dt分析物参加反应的速率；3.化学发光强度与化学发光分析的依据在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂少得多，对于一级动力学反应：dc/dt=Kc；K为反应速率常数。定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：4.装置与技术装置流程：发光反应室光检测器信号放大器显示与记录

发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：

静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；

流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；5.特点

灵敏度极高例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量仪器设备简单

不需要光源、单色器和背景校正；发射光强度测量无干扰

无背景光、散射光等干扰；线性范围宽分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。

5-2-2发光反应的类型与应用1.气相化学发光反应用于大气中O3、NO、NO2、H2S、SO2、CO等组分的监测。a.一氧化氮与O3的发光反应

NO+O3→NO2*NO2*→