肽与蛋白质HPLC分析和纯化手册

第一章 简介：肽和蛋白质的反相HPLC分析与纯化反相高效液相色谱〔RP-HPLC〕已经成为一种分析和纯化生物分子广泛而牢靠的方法。RP-HPLC在肽、蛋白质分析和纯化方面的重要作用在于它的分别度：RP-HPLC能够分别具有个氨基酸残基的多肽通常可以用RP-HPLC1变异物的分子量都在5300异物都可以用RP-HPLC亚甲基的不同——兔胰岛素有一个苏氨酸，而人胰岛素有一个丝氨酸！RP-HPLC图1.RP-HPLC分别含有一个不同氨基酸的人和兔胰岛素。色谱柱：VYDAC214TP54洗脱液：27-30%ACN+0.1%TF1.5mL/mi25mi。科学文献中已有很多用RP-HPLC生长因子与其未氧化态类似物已得到分别，白细胞介素-2突变蛋白也已经得到分别。在最近的论文中，KunitaniRP-HPLC30-2。他们得出结论：蛋白质的构造在反相分别中格外重要，同时，RP-HPLC也能用来争论蛋白质的构造。在该过程中，他们呈现了RP-HPLCRP-HPLCRP-HPLC于纯化克及毫克量的合成肽。RP-HPLC能用于分别血红蛋白变体，鉴别微粒种类，争论酶亚基和细胞功能。RP-HPLC还能纯化用于序列测定的微量级肽，并纯化治疗用的毫克级到千克级生物技术衍生多肽。反相HPLC广泛用于生物制药领域的蛋白质治疗制品的分析。通过分析蛋白质治疗制品的酶消化物能识别蛋白质，并检测基因变化与蛋白质降解〔脱酰氨和氧化〕产物。用RP-HPLCVYDAC就已呈现指数级的增长，如图〔又见参考资料7。GraceVydacHPLC2。美国专利局公布的1984-2023VYDAC®反相HPLC其次章多肽与RP-HPLC色谱柱的作用机制了解多肽与反相外表的作用机制对于理解RP-HPLC〔3了。多肽/反相之间相互作用的吸附/脱附模型图3.流淌相中的多肽进入色谱柱。多肽的“疏水脚”吸附到疏水性的反相材料外表，当有机调整剂浓度升到临界浓度时，多肽就脱附下来了。可以认为多肽是“坐在”固定相上面的，多肽分子的大局部都暴露在流淌相中，只有RP-HPLC是基于多肽之间“疏水脚”的微小差异“疏水脚”的不同源于氨基酸序列的不同与构造的不同。多肽与疏水相之间吸附/脱附机制的关键〔Geng和RegnierZ”值格外准确，所以脱附只在很狭窄的有机调整剂浓度范围内发生〔图敏感性，是分别多肽时RP-HPLC具有选择性的缘由。当到达临界浓度时，多肽突然脱附并产生尖峰。“Z”值对蛋白质构造的敏感性和在调整剂临界浓度时的突然脱附，使得RP-HPLC能分别格外相像的多肽〔见第2页〕。分子保存时间与有机调整剂浓度图4.A：由于是通过安排而保存，联苯等小分子的保存时间随着有机调整剂浓度的增加而渐渐削减：当有机调整剂浓度到达能脱附多肽的临界浓度时，溶解酵素等多肽的保存时间发生突然而猛烈的变化，证明白多肽—反相外表之间相互作用的吸/脱附模型。使多肽能够得以分别的“疏水脚”对分子构造格外敏感。RP-HPLC对蛋白质构造的敏感Kunitani和Johnson觉察，由于构造的差异，格外相像的白细胞介素-2突变蛋白也能得到分别，包括Geng和Regnier“Z”值多肽在色谱柱中的吸附/脱附只发生一次。脱附后，多肽和反相柱子外表就没有什么相互作用了，随后的相互作用也不会对分别产生多少影响。机调整剂浓度的敏感性如图5所示。溶菌酶的保存时间发生了很大变化，而乙腈的浓度相对地只有微小变化。多肽的保存时间对调整剂浓度微小变化的敏感性使得等度洗脱比较困难，由于有机调整剂地浓度必需维持在格外准确的范围内。多肽RP-HPLC分别通常承受梯度洗脱，即使梯度很小〔即单位时间内有机调整剂浓度变化很小〕。乙腈浓度对洗脱的影响图5.ACN浓度为39%时，溶解酵素的保存时间约18ACN40%时，保存时间削减一半还多，只有7.6分钟。ACN42%时，溶解酵素的保存时间又削减一半，只3.1分钟。色谱柱：VYDAC214TP54洗脱液：39%、40%、42%ACN+0.1%TFA。当等度分别不适用时，可以承受小梯度有效地分别相像的多肽。小肽进展色谱分别时安排和吸附同时发生。当有机调整剂浓度变化时，它们脱附的速度比发生安排的小分子要快，但与蛋白质相比，它们是渐渐脱附的〔图6〕，说明其分别机制由此可见，螺旋状肽上疏水残基的准确位置，在推想肽的保存值时很重要。由于大的多肽集中缓慢，所以其RP-HPLC的峰比小分子的要宽。等度洗脱的多肽的峰宽5-10等度洗脱。肽的保存时间图6.RP-HPLPentaphenylanin苯脱附得快，但比溶菌酶慢。小肽的色谱机理似乎是混合的。HPLC分别中色谱柱的作用HPLC色谱柱为多肽吸附供给疏水性的外表。色谱柱由不锈钢管构成,内部填充微径、球形聚合物〔比方聚苯乙烯-二乙烯基苯〕也可以用作多肽的HPLC吸附剂。吸附剂的孔径HPLC吸附剂是多孔微粒，用于反响的外表大局部位于小孔中。因此，多肽分子必需进入孔中才能被吸附和分别。HPLC曾多年使用孔径约100Å大而无法进入这种直径的孔中。GraceVydac为HPLC改进的大孔径(～300Å)球形硅胶微粒宣告了用RP-HPLC有效分别多肽的开头。今日，虽然有些肽(<～2023MW)也能用100Å孔径的微粒分别，但大多数多肽都是用孔径约300Å的微粒填充色谱柱来完成分别的。吸附剂粒度色谱柱中吸附剂的粒度影响洗脱峰宽，小直径的微粒通常产生更尖的峰和更高的分别度。毛细分析和少量制备分别推举使用5〔色谱柱内径10mm谱柱通常装填10µm的材料。内径大于22mm的过程色谱柱通常装填15µm或更大的微粒，其粒度安排也比用于分析型色谱柱的宽〔见40-42页〕。色谱柱的选择与样品分子的特性7.不同分子量和疏水性所推举的粒度和结合力吸附相种类PLC吸附剂，这些硅胶基质分子上有一个能附着疏水基团的活性氯基。形成疏水相的烃基通常是十八碳(C18)、八碳(C8)或四碳(C4)的线性脂肪族烃。烃链的长度在蛋白质分别效果上一般没有什么不同75000道尔顿的小分子蛋白质最好选用C18色谱柱。最小的分子和最亲水的肽通常在小孔的C18柱子上分别得最好。大于5000道尔顿的蛋白质或小分子多肽格外疏水，最好选用C4色谱柱。C8柱与C18色谱柱的应用差不多，但分别C4多肽表现出独特的选择性。反相外表的微小差异有时会造RP-HPLC对多肽选择性的不同，可以利用这一点来优化特定肽的分别。如图8所示，肽分别的选择性可能受疏水外表性质的影响。图中所示的五种肽的选择性在C18和C4C4C18在C18柱上稍长。不同反相色谱柱上的肽分别图8.色谱柱：VYDAC218TP54(C18);214TP54(C4);219TP54〔苯基〕洗15-30%ACN+0.1%TF1.0mL/mi30min123I，4.5.I血管紧急素I含有一个组胺酸，血管紧急素II含有两个组胺酸。在苯基柱子上，这两者都比其它肽洗脱得早。分别肽时〔比方蛋白质消化物中的肽〕，最好试用不同的疏水相，以选出针对特定肽混合物具有最正确选择性的相来。肽的RP-HPLC分别基于肽和反相外表之间的微妙作用。反相外表的微小变化能影响肽的分别，虽然小但很重要。有些肽的分别对键合在硅胶基质上的疏水相的密度和均匀度格外敏感〔图9〕。低碳装填色谱柱分别度的提高图9.C18RP-HPL色谱柱〕分别在标准碳装填色谱柱〕上只有局局部别的两种肽色谱柱：A.VYDAC218TP52C1,5μm,2.1x250mmB.VYDAC218LTP5

5μm,2.1x250mm洗脱液：6mMTFA/4mMHFB11-95%ACN,0.25mL/min,75minAsp-蛋白质消解物。不同的反相吸附剂在分别蛋白质酶消化物中的肽碎片时可能表现出不同的选择性。 用两种RP-HPLC色谱柱分别β-乳球蛋白A的胰蛋白酶消化物碎片，结果说明：不同的相有时对肽的反相分别具有微小的影响〔图10〕。与通常使用的C18色谱柱相比，C4柱的保存时间稍短，肽碎片洗脱图形也有某些程度上的不同一有用的方法。有些试验室利用反相色谱柱的选择性差异来进展肽的二维分别。不同反相色谱柱对胰蛋白酶消化液的分别图10.VYDAC218TP54(C214TP54(0-30%ACN+0.1%TF1.0mL/mi，18 460min样品：βA的胰蛋白酶消化液。什么是聚合物键合？它又是怎样影响肽的选择性的？ 反相HPLC吸附剂一般通过把含有一个活性氯的氯硅烷烃键合到硅胶基质上制成这些就形成了所谓的单体键合相它在硅胶基质上有一个附着点也可以用具有多个活性氯的氯硅烷烃这就是所谓的聚合物键合相单个氯硅烷烃在相中交联并在硅胶基质上面形成硅氧烷聚合物同时附着多个疏水链虽然单体键合相与聚合物键合相的疏水性和分别特性相像但在分别肽时尤其是蛋白质的酶消化物中的肽时它们会具有不同的选择性这种不同的选择性为色谱工作人员优化蛋白质消化物和其它肽的选择性和分别度供给了更多的选择空间图11给出了用单体键合吸附剂和聚合物键合吸附剂分别一系列合成多肽的例子这些肽分别选择性的明显差异已经标出但同时也供给了进展肽分别时对色谱柱的另一种选择。单体键合与聚合物键合C

反相色谱柱对合成肽的分别18图11.VYDAC218TP5238TP55μm,4.6x250mm)10-40%ACN+0.1%TF30mi。1.0mL/mi。合成聚合物吸附剂的作用HPLCpH和四周温度的温存条件下表现良好，但在极端条件H、高温〕下，硅胶色谱柱的效果就会降低。合成聚合物〔比方比方聚苯〕能为多肽分别供给机械强度高的基质。硅胶色谱柱在中度pHpH〔比方盐酸胍12表示的是用合成对苛刻的条件下用合成聚合基质进展多肽分别成为可能。PS-DV3色谱柱对几种肽的分别图12.合成聚合物色谱柱〔聚苯乙〕色谱柱：VYDAC259VHP5415(PS-DVB,5μm4.6x150mm)130%ACN+0.1%TF15mi。1.0mL/min1234.1–85III6.val-4IIIpH13，在这个例子中，基于聚苯乙烯-二乙烯基苯的色谱柱可以用强碱〔1N氢氧化钠〕和强酸〔1N硫酸〕进展和分别度，这证明用强试剂清洗柱子并不会对色谱柱的性能产生负面影响。色谱柱用极值pH清洗前后对肽的分别状况图13.用强试剂清洗前〕1NNaO清洗后〕1硫酸清洗后〕，合成聚合物〔VYDAC259VHP5415(PS-DVB,5m,4.6x150mm)0.1%TFA，15min流速：1.0mL/min肽：123.III4.素5.神经紧急素色谱柱尺寸：柱长影响蛋白质分别的吸附/脱附几乎全部发生在色谱柱的顶端。因此，柱长并不显著影响蛋5-15cm长柱子分别较好，15-25cmStone和Williams150mm〔80个峰和50mm〔65个峰250mm〔104个峰〕能从羧甲基转铁蛋白的胰蛋白酶消化物中分别出更多的肽碎片。柱长对分别的其他方面也有影响。样品容量样品容量是色谱柱体积的函数。对等直径的柱子而言，柱子越长样品容量越大。柱压柱压与柱长成正比。当用异丙醇等粘性更大的溶剂时，较短的柱子会产生较低的柱压。柱子尺寸：直径柱子直径不影响峰分别，但影响进样、溶剂使用和检测灵敏度。HL柱子直径的减HPLC柱子尤其有用。分析1-200微克多肽样品的分析柱标准直径是4.6mm。较大直径的色谱柱用于大量多肽的纯化〔见40-48页制备分别〕。近年来，小直径柱子〔0.075mm到2.1mm〕的使用有所增加，由于小直径柱子有以下优点：削减溶剂用量用于毛细色谱柱和小孔色谱柱的流速为每分钟几微升〔见50页附录A〕。低流速能显著削减多肽分别所需的溶剂量。增加检测灵敏度低流速的小孔色谱柱洗脱多肽所需的溶剂体积较少。检测器反响随着流速的降低而增加。流速200mL/min的窄径柱的灵敏度是流速1.0mL/min分析型色谱柱的六倍。能处理小量样品检测灵敏度增加意味着能检测小量样品RP-HPLC柱能分别和收集5纳摩尔的胰蛋白酶消化产物。与质谱接口HPLM阿摩尔级的单个样品进展常规检测。〔见28-31页LC/MS〕。小直径色谱柱的当今趋势窄径柱内径2.1mm的微孔柱流速为100-300mL/min的试验室来说，微孔柱是一个有用的措施。大局部标准HPLC系统都能在这些低流速下运行，而很少需要或不需要修改。200mL/min左右的微孔柱与空气关心质谱有很好的接口。微孔柱和毛细柱虽然使用直径1.0mm它们的HPLC系统需要修改，或用于该目的的特制仪器。进展数据流分割后，毛细色谱柱能与电喷雾甚至纳升电喷雾质谱仪接口。Davis和Lee的在一篇论文中供给了用微孔柱和毛细管柱取得最正确性能的有价值的信息得使用小孔色谱柱的人阅读。很多期刊都有关于质谱与毛细管柱联用的具体论文〔26-29页〕。例子图14表示的是用微孔柱〔内径1.0mm〕对血红素的胰蛋白酶消化物的分别。用微孔柱〔1.0mm〕对血红素的胰蛋白酶消化物的分别图14.用微孔RP-HPLC色谱柱对血红素的胰蛋白酶消化物的分别〔6〕色谱柱：C18,1.0x250mm(VYDAC218TP51) TFA水B为0.1%TFA乙腈溶液。图15所示的是用内径75µm的毛细管柱对肌球素的胰蛋白酶消化物分别的例子。毛细管柱〔75µm〕对肌球素的胰蛋白酶消化物的分别图15.毛细RP-HPLC色谱柱：C18(VYDAC218MS),75μm，毛细管柱流速：0.5μL/min水/TFA/乙腈的梯度洗脱。图16表示的是用内径300µm的毛细管柱对3皮摩尔BSA的胰蛋白酶消化物的分别，承受质谱检测。毛细管RP-HPLC色谱柱对BSA胰蛋白酶消化物的分别图16.30µmRP-HPLBS的胰蛋白酶消化物的分别。皮摩尔VYDAC218MS5.3055μm,300A,-C18反相柱(300μmx50mm流速：5μL/min.流淌相:A=0.198,2%CAB=0.1%98%ACN,23%0-3%渐变65mi50%70mi75%。检测器：质谱M〕。〕(b基峰是指色谱图中每次振幅最大时的单个质谱峰。基峰的色谱图强调了含有单个主要分子的峰，消退了特别峰和噪声。HPLC多肽分别中流淌相和温度的作用把多肽从RP-HPLC柱子上脱附和洗脱下来用的是含有机调整剂和离子对溶剂或缓冲液的水pH〔溶剂梯度〕的方法。当溶剂到达能引起脱附的浓度时，多肽就从色谱柱子上脱附并洗脱下来。有机调整剂有机试剂的作用是把多肽分子从疏水性的吸附表层脱附下来，渐渐上升有机溶剂的浓度〔梯度〕，直到多肽脱附并洗脱下来。乙腈〔ACN〕是最常用的有机调整剂，这是由于它：易挥发，简洁从收集的组分中除去；粘度低，柱压小；短波几乎无紫外〔UV〕吸取；经长期使用证明，其在RP-HPLC多肽分别中牢靠。异丙醇异丙醇的粘度而保持其疏水性，我们建议使用乙腈：异丙醇为50:50的混合液。在有些状况下，在乙腈中加1-3%的异丙醇能增加蛋白质的回收率。乙醇RP-HPLCFDA等治理机构所生疏。乙醇已用于洗脱疏水性的跨膜蛋白质，也用于纯化处理。甲醇或其它溶剂甲醇或其它溶剂与常用的溶剂相比没有什么优点，而且不用与多肽分别。洗脱梯度洗脱多肽几乎总使用梯度溶剂。渐渐增加有机溶剂的浓度，能得到最锐利的峰和最好的分别度。0.5-1%。像每分钟0.05-0.1%1〔见第2页中胰岛素变异物的分别所用的梯度斜率每分钟只有0.25%。图17说明，对蛋白质来说，削减梯度的斜率通常能提高分别度。承受低梯度时酶亚基分别度提高图17.色谱柱：C18(VYDAC218TP104)流速：1mL/min25%到50%ACN的TFA水溶液。样品：C21。3-595%。有机浓度过高会洗去全部有机相上的水，也会使柱平衡更加困难。梯度斜率对肽选择性的影响由于有些肽和反相柱子外表发生作用的方式有微小的差异，所以溶剂梯度的斜率可能会影响肽的选择性，由此影响肽之间的分别度。说明这种影响。图18中是在三种不同的梯度斜率〔时间〕，对人生长激素的胰蛋白酶消化物一些碎片的分别。随着斜率的降低，碎片9和10的表现和预期的一样，即分别度随着梯度斜率的降低〔梯度时间增加〕11和12表现不同。分别度随着梯度斜率的降肽对的影响，当温存地转变梯度斜率时，要对这种影响进展监控。不同梯度时间肽的分别图18.〔坡度C18,150x4.6mm1mL/minA.45minB.115minC.180mi60%ACN+0.1%TF水溶液9、10、11、12、1338。离子对试剂和缓冲液离子对试剂或缓冲液调整洗脱pH值，并与多肽作用，从而加强分别。三氟乙酸应用最广的离子对试剂是三氟乙酸〔TFA〕，其应用广泛的缘由是：易挥发，易于从收集组分中分别；短波段几乎无紫外〔UV〕吸取；经长期使用证明，其在RP-HPLC多肽分别中牢靠。TFA通常使用的浓度为0.1%〔w/v〕左右。0.5%的TFA浓度用来溶解更大分子的或更疏水的蛋白质；低浓度的TFA则间或用于胰蛋白酶消化物的分别。虽然进展的色谱柱允许使用更低浓度的TFA，但当TFA浓度低于0.1%时，蛋白质的色谱图峰形会退化〔见28页〕。假设用TFA浓度不变的洗脱梯度，当在210-220nm检测时，有时会消灭基线漂移。水溶剂到非水溶剂的介电常数的变化会影响π–π190-250nmTFA光谱吸取造215nm，并在B液中比A液少加15%的TFA以补偿基线漂移。比方，A液中用0.1%的TFA，B液中用0.085%的TFA。使用质量好的和小量的TFATFA图中会消灭假峰〔见附录B〕。TFA浓度对选择性的影响三氟乙酸的浓度会影响特定肽对的选择性或分别度。虽然流淌相中TFA的浓度通常在0.05-0.1%之间，但转变TFA的浓度也会对肽的选择性产生微小的影响，见图19。这就意味着，要得到好的重现性，在肽分别方法中，慎重把握TFA的转变TFA的浓度，能进一步优化肽对之间的分别度。TFA浓度对肽选择性的影响图19.TFA色谱柱：C18(VYDAC218TP54)流速：1mL/min洗脱液：TFA0-50%CAN，浓度如以下图。样品：注：图中显示的是色谱图的一局部。虽然TFATFA的分别中〔图20〕，有些肽用磷酸盐得到了比用TFA更尖的峰，使催产素与缓激肽的洗脱挨次TFATFA洗脱得早，由于TFA与缓激肽中的两个TFA分别时隐蔽着的两个小杂质，在用磷酸盐分别时显现出来了〔20。盐酸也颠倒了催产素与缓激肽的洗脱挨次，并分别出TF时看不见的杂质〔20。肽分别时TFA及替代性离子配对试剂/缓冲液的比较图20.218TP54C.5mMHCl,pH2.0肽：123II45.I。七氟丁酸〔HFBA〕能有效地分别碱性蛋白质，三乙胺磷酸盐〔TEAP〕已用于制备分别。有TEAP比用TFA10-60％浓度的甲酸已用于格外疏水性多肽的色谱分析。甲酸也用于肽的LC/MS分别，由于TFA被证明在肽的LC/MS中很有效〔见26-29页关于LC/MS的具体争论〕。Guo及其同事比较了TFA,HFBA和磷酸在肽洗脱中的使用，觉察它们都有不同程度的选择性。pH对肽分别的影响pH21所示。pH4.4时〔图21B〕五种肽都比在pH2.0时〔图21A〕洗脱得早，肽的保存时间也相对发pH2.0pH4.4时同时洗脱。pH6.5时〔图21C〕肽的保存时间比在pH4.4时要长，但洗脱挨次有很大不同，血管紧急素II,在pH2.0-4.4pH工具。合成聚合物反相材料将实际pH的范围扩大到将近pH14〔见13页的图13〕。如图22所示，肽在高pH值时与低pHpH值从2变到9明显的转变。pH图21.用磷酸盐作缓冲液，pH在2.0、4.4、6.5时五种肽的洗脱。VYDAC218TP54,pH2.0B.20mM,pH6.5肽：1.23.II45.血管紧急素I.用HPLC从蛋白质消化物中分别肽碎片的操作条件0.1%TEA作为李子配对试剂，但用别的离子配对试剂或H有时能得到更好的分别度。TFA广泛用作离子配对试剂，也是肽分别的最好起始点。但是也要考虑使用磷酸盐或盐酸等缓冲液，或争论pH的影响，以优化肽的分别。为了测试pH的影响，配制100mM磷酸盐溶液〔pH约4.4〕。取三分之一用磷酸调整到pH2.0，三分之一用NaOH调整到pH6.5。然后稀释每份溶液至10-20mM用作洗脱缓冲液。用TFA测肽的分别度，这三份磷酸盐缓冲液〔pH2.0，pH4.4，pH6.5〕和盐酸都是为了实现良好的肽分别而查找最优试剂和pH条件的很好的方法。合成聚合物〔聚苯乙烯-二乙烯苯基〕色谱柱在低和高pH时对肽的分别TFApH2.B.15mMNaOH,pH9.流速：1.0mL/min肽：1234.神经紧急素1-85.血管紧急素III.6.val-4III流淌相流速流速对多肽分别没有什么影响。流速不影响多肽从反相外表脱附和之后的保存时间。流淌相流速的影响。洗脱流速会影响小肽的分别度，这是由于小肽在RP-HPLC色谱柱上的行为介于蛋白质和小分子之间〔见第4页〕。Stone和Williams觉察，从羧甲基转铁蛋白的胰蛋白酶消化物中分别出的肽碎片的数量取决于洗脱流速。在分析型HPLC色谱柱上，流速0.2mL/min时，只分别出不到800.8mL/min时能分别出1160.5-1.0mL/min之间，分别出的肽碎片数量没有什么变化。度微小的提高。流速也会影响分别的其它方面，比方：检测灵敏度低流速只能洗脱小量的多肽，吸附与敏感度也因此增加。HPLC窄径色谱柱能提高检测灵明度，这主要是由于它能在低流速下运行，洗脱多肽所用溶剂的量也很小。样品溶解性高流速能提高熟水性多肽的溶解性，虽然这样也会增加纯化该样品的溶剂用量。柱压柱压与流速有直接的关系。流速越大，柱压越高。梯度流速的变化会影响梯度斜率与峰形调整流速会转变其对梯度斜率的影响而转变分别度。温度对肽分别的影响柱温会影响溶剂粘度，柱压和保存时间，也会影响肽的选择性。肽做色谱时温度是一个重要的分别参数。在每个HPLC方法中，应当优化温度分别多肽。如图2320oC时，碎片11、12、13几乎13的保存值比碎片11、12要长，所以40oC时这三者的分别度很好。但60oC时，碎片11和12同时洗脱，说明白随温度上升，选择性的变化。在20oC时，碎片15比碎片10洗脱得早，40oC时它们几乎同时洗脱，60oC时碎片10首先洗脱，两者得到很好的分别。这些结果说明白温度对肽选择性的重要影响。温度对肽分别的影响图23.C18,4.6x150mm1mL/min.梯度渐变60%CAN+1%TFmin。温度：如以下图样品：39。第八章用HPLC纯化和分别多肽RP-HPLC50mm或更大的色谱柱用于纯化克级量的用于临床试验或商业药品的重组蛋白质〔见附录A、以及优化洗脱梯度。液的变化、不同离子配对试剂或缓冲液的使用、以及梯度条件的变化。化，这些大尺寸柱子和试验室规模常规分别所用柱子的分别特性几乎一样。分别材料的选择产程规模反相分别的材料能得到和分析型反相色谱柱几乎一样的分别特性。VYDAC300A的硅胶微粒大小从不到5微米到几乎30微米不等〔图4510VYDACTP-300A孔径硅胶的粒度分布40.530析规模材料具有几乎一样的蛋白质和肽选择特性，它的加工工艺与分析型大小的硅胶一样，51015-20蛋白质就说明白这一点〔图41。三种柱子的蛋白质选择性和保存时间是一样的。不同微粒——10-15、15-20或20-30μm——通常用于大规模纯化，由于它们比小分子材料廉价，产以得到最大样品通量〔见43页。当色谱柱“超载负”时，大微粒材料和小微粒材料的性能42510的峰宽和分别度要好很多2-3倍峰宽只比用较大微粒材料的大20-50%左右。柱子超载负时，小微粒略微的分别度的优势并不能弥补其本钱高、柱压高以及在工艺应用中的实际困难。不同粒度RP-HPLC色谱柱的蛋白质分别图41.不同粒度反相材料的蛋白质选择性一样，它们之间唯一的区分在于，随着粒度的增加，峰宽增大，色谱柱材料：A.VYDAC214TP,5μm 214TP,10μmC.VYDAC214TP,15-20μm流动相：24-95%ACN+0.1%TFA，1.5mL/min，30min放大洗脱条件特性。洗脱溶剂试验室规模的纯化通常使用和分析型色谱一样的有机调整剂，即乙腈。离子对试剂或缓冲液试验室规模的纯化通常使用和分析型色谱一样的离子对试剂或缓冲液。梯度特性22mm4.6mm23〔224.6，平方1.0mL/min3030mL。要把该方法应用22mm23690mL23延长梯度时间，流速也会局部地增加。比方，流速为23mL/min30分钟，梯度体积为690mL10mL/min69常设置得更低——即单位时间内有机调整剂浓度增加较小——以增加分别度要多肽时。不同粒度RP-HPLC材料的蛋白质进样量图42.虽然低进样量时小粒度材料的峰宽很窄，但承受高进样量即色谱柱“超载负”时，峰宽仍没太大变色谱柱材料VYDAC214TP,5μmVYDAC214TP,10μmVYDAC14TP,1520μmVYDAC(R)214TP,2030μm洗脱液：24-95%CAN+0.1%TFA水溶液，1.5mL/min，30min核糖核酸酶过程放大纯化：多于五克的肽洗脱剂等溶剂在过程色谱时更适用一些。乙醇相对来说无毒、与水混合时不易燃、本钱低并被FDA等治理机构所生疏。乙醇目前用于大规模过程纯化。离子配对试剂或缓冲液通常用于分析型色谱的离子对试剂不太适用于过程放大色谱子配对试剂或缓冲液包括乙酸〔〕种生物技术多肽治疗剂的分别。梯度特性依据大柱子而放大洗脱梯度的试验室规模纯化能用于过程放大纯化〔见上用梯度通常都很小。一针色谱分析中能纯化多少肽？假设RP-HPLC分别的目的是收集纯化的多肽以备进一步使用衡以下三个因素：通量给定时间内纯化的多肽量。虽然低载负产生最大的分别度，但每针色谱分析时纯化量较少，通量也较低。纯度纯度用最终纯化产物的重量占总重量的百分数来表示到，虽然这会限制柱子能载负的样品量。产量大局部多肽。假设分别度较低，则收集峰的中间局部，这样就削减了产量。RP-HPLC最正确分别度时的载负容量；实际样品载负量柱子允许载负的最大多肽量。最正确分别度时样品载负力气0%的分析物最大量。对大多数多肽来说，分析柱〔直径4.6mm〕在到达“超载负”点前，峰宽和分别度保持不变的样品量在100到20μg〔图4。度降低。核糖核酸酶在分析色谱柱上的进样曲线43.进样量直到200μg200μg实际进样范围是200-5000μg。色谱柱：VYDAC214TP54(C4,5μm,4.6x250mm)洗脱液：24-95%ACN+0.1%TFA，30min样品：核糖核酸酶实际样品载负量样量多于最正确分别度定义的样品量。随着样品载负增加，多肽的峰宽也随之增加〔图43和4，但峰形仍保持对称。这就允许样品载负量可以是定义样品量的10到50倍，而仍能保持可承受的分别度。4425、100、200、500100025100μg〔在最正确分别度的范围内〔图44A,100g“超载负”点〕20g进样量时，峰宽明显增加，导致分别度降低〔图4450g时，分别度显著降低〔图441000g时，杂质峰与核糖核酸酶的峰完全重合〔图44。进样量对蛋白质峰形和分别度的影响44.A.每种蛋白质25μgB.每种蛋白质100μgC.每种蛋白质200μgD.每种蛋白质500μgE.每种蛋白质100μgYDAC214TP54(C4,5μm,4.6x250mm25-50%CAN+0.1%mL/min，25min样品：核糖核酸酶和溶菌酶200μg时仍保持不变，但之后分别度就渐渐削减了。在50μg时〔图44100g时〔图44，杂质峰和溶解酵素峰就完全重合了。蛋白质和杂质峰可以通过运行一个更小的梯度提高分别度。由于核糖核酸酶和溶解酵素的分别度甚至在1000μg5x30cm1.25x25cm5多肽最大结合量多肽在反相色谱柱上的最大结合量取决于多肽的大小和性质材料10mg肽——在4.6x250mm色谱柱上结合25mg。较高的肽结合量为每克分别材料10-20mg虽然接近色谱柱最大结合量的样品量分别度很小通量和分别度的优化方法样品浓度样品的浓度会影响相邻洗脱的多肽的分别度建议使用小梯度相邻洗脱的多肽之间可以通过使