厌氧颗粒微生物群落空间分布的研究进展

厌氧颗粒微生物群落空间分布的研究进展

1种严格厌氧细菌1973年，feld在上午发明了该装置，并对其进行了改进的物理和化学性质特征的产甲烷性能较高（a类）。厌氧产甲烷颗粒污泥是在特殊工艺条件下形成的由多种厌氧微生物共同组成的微生物聚集体。其中各种兼性微生物如水解菌、发酵菌、产酸菌等,以及各种严格厌氧细菌如产氢产乙酸菌、硫酸盐还原菌、产甲烷菌等以共生或互生关系生成在一起,形成了一条将复杂有机物经过水解、产酸、产氢、产乙酸、产甲烷等步骤最终转化为CH4和CO2的完整厌氧消化过程。多种厌氧微生物在颗粒污泥中形成了一个完整的微生态系统,在该系统中,各种性质各异的微生物按照其各自不同的生态级别,生长和分布在颗粒污泥中的不同的空间位置,负责各自生态功能,并相互抵挡和消除不利环境条件或抑制物质。如此复杂、高效的微生态系统,其结构和微生物组成及空间分布引起了许多研究者的兴趣。目前,国内外很多学者对厌氧颗粒污泥的形成机理,工艺条件,微观结构,以及利用传统微生物学的方法对其中的微生物组成等均已进行了大量研究。在早期,受限于技术手段,仅能采用诸如分离培养、电镜观察等对颗粒中的微观结构、菌种组成等进行一些初步研究,所得结构多为假想结论。近年来,随着现代分子微生态技术的发展,国外的一些究者利用PCR,DGGE,FISH等先进的手段深入地对颗粒污泥中的微生物种群结构和空间分布进行了研究,取得了一定的研究成果。2微生物16srdna的序列分析由于颗粒污泥内微生物聚合体与个菌群之间的生长代谢依赖关系,导致微生物组成和鉴定研究上的复杂性。以往的研究主要借助荧光显微、电镜技术,可以从形态上在属级分类水平对常见的产甲烷细菌进行初步鉴定。另外还使用了限制性培养基培养菌群稀释计数法和MPN法等传统的微生物学研究方法,然而培养结果与真实数量间存在着极大的差异。自从1985年,Pace等第一次通过核酸测序技术以rRNA确定环境样品中的微生物以来,分子生物学技术在微生态学领域逐渐得到应用。由于rRNA基因序列的高度保守性及多样性,可根据其序列的相似程度反映出它们的系统发育关系,被人们称为微生物的“活化石”。16SrRNA序列分析已经成为细菌分类鉴定的标准方法。分子生物学技术的应用,为废水厌氧处理系统中细菌种群结构的研究提供了一个新的具有更多优势方法,可在无需纯培养和不扰动环境样品的情况下,对样品中的微生物直接进行研究。通过研究不仅可以了解特定环境中的微生物组成,还为从中分离特异类群的微生物提供了指导。值得一提的是,与真细菌相比古细菌具有较为特殊的细胞壁结构,较难破壁,所以对厌氧颗粒污泥的DNA提取应采用滚珠振荡机械破碎法,以提高对古细菌DNA的提取效率。目前较常用的分子生态学分析方法可分为三大类:(1)多样性分析:通常使用的是变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)和限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)等方法,可以将混合样品中的不同种类微生物通过电泳等方法分离开来。(2)定性分析:主要是结合测序分析,通过对微生物16SrDNA序列的分子克隆技术或者长片段的DGGE产物进行测序、比对分析等,可以得到群落中各各种类微生物较全面的分类学信息。另外,通过特异性探针的荧光原位杂交实验,可以有目的地对微生物样品中的种类进行鉴定分析。(3)定量分析:目前使用较多的是狭缝杂交(SLOT-BLOT)、荧光实时定量PCR和FISH技术。荧光实时定量PCR技术可以通过标准品对目标微生物进行绝对定量分析,是目前环境微生物领域较为精确快捷的定量方法。颗粒污泥使用FISH技术的难点是对颗粒污泥进行前期切片分层处理,目前常用的有石蜡包埋切片法和快速冷冻切片法,石蜡包埋切片法的过程繁琐,需要固定、脱水、包埋、切片、展片、脱蜡等,但效果较好。根据目前对古细菌的研究结果,先将较为常用的古细菌研究中使用的16SrDNA的引物序列进行总结,如表1所示。产甲烷古细菌的分类及相关探针总结如图2,目前的分类将甲烷八叠球菌MSMX860另列为单独的一个目。3微生物群落结构厌氧生物法主要用于处理的各类难于降解的高浓度有机废水,包括啤酒废水、油脂类废水、制药类废水等。以往的研究结果显示,降解啤酒、葡萄糖、蔗糖、淀粉的颗粒污泥的层次结构大多相似,通过电镜可见在其多层次结构的外层,主要是产酸菌类,中间层是综合营养型的产甲烷菌类包括利用氢的产甲烷菌和产氢产乙酸菌,内层是产甲烷鬃毛菌。一些学者以微生物16SrDNA为基础,利用现代分子生物学方法对厌氧颗粒污泥中的微生物群落结构进行了详细分析。下面是对各类废水厌氧处理过程中颗粒污泥微生态学研究结果进行的总结。3.1颗粒污泥中真细菌和古细菌的层序和组成变化啤酒废水的处理首先要求水解和发酵细菌将啤酒降解为简单的糖类和一些短链脂肪酸,经过进一步降解,最终转化为甲烷。Liuwentsao和ChanOnchim等利用分子克隆、狭缝杂交、DGGE和FISH技术对处理啤酒废水的厌氧颗粒污泥中微生物群落进行了研究。利用分子克隆得到的30个古细菌克隆和94个真细菌克隆,通过DGGE筛选不同的克隆,发现古细菌主要有4条独立条带,都属于鬃毛甲烷菌。而真细菌克隆得到14条独立条带,8条为低GC的革兰氏阳性细菌,数量占总细菌的51%,其中的6条是球胞梭菌(Clostridiumsporosphaeroides),可独立成为一群;3条为γ亚纲变型细菌,数量占真细菌的32%,测序结果发现与黄胞菌中的种类相似;3条为δ亚纲变型细菌,数量占真细菌的17%,都是脱硫菌(由于可隆结果体现的微生物多样性与克隆出的菌株数量成正比,所以得到的克隆有可能遗漏一些微生物的种类)。Liuwentsao等使用了古细菌分类的主要几类产甲烷细菌探针MB1174,MC1109,MG1200,MSMX860进行FISH实验检测,结果显示它们都存在,它们相对于总古细菌的数量相应为5.3%,1.6%,25.7%和67.1%。同时使用了从属于甲烷八叠球菌目的甲烷鬃毛菌属(Methanosaeta)探针MX825杂交发现其数量占甲烷八叠球菌目的54.3%,占总古细菌数量的34.2%,是颗粒污泥古细菌中的优势细菌,这与克隆结果相符。利用真细菌探针EUB-338和古细菌探针ARC915结合FISH技术显示出颗粒污泥中真细菌和古细菌的层的结构。真细菌主要在颗粒表层,古细菌主要在颗粒内部核心(图2),另外偶尔古细菌在表面,真细菌在内层会观察到。3.2微生物种群结构一般来说在油脂废水的处理中会出现降解β-氧化饱和脂肪酸的互生菌群,它们会通过β氧化过程将丁酸或较长链脂肪酸转化为乙酸和氢气,为产甲烷菌进一步降解提供基质。互养产乙酸细菌是颗粒污泥中的另一重要代谢群。目前已描述的降解脂肪酸和苯甲酸的互养细菌位于系统发育学的两个分支,即低GC革兰氏阳性菌的互养单胞菌科和δ变形菌的互养杆菌、密斯氏菌互养菌群Maria,Kees等对处理油脂类废水的EGSB反应器中颗粒污泥微生物种群结构进行了分析。首先利用P7f和P1510r引物对所有细菌扩增后进行分子克隆。并利用真细菌和古细菌特异性引物进行了扩增,结合DGGE和测序技术对真细菌与古细菌的多样性能够进行分析。结果发现有11种真细菌和7种古细菌出现。11种真细其中有3种属于互养单胞菌属(Syntrophomonas),其他多为不可培养细菌。7种古细菌中有3种甲烷鬃毛菌,其他4种属于甲烷杆菌。Maria和Zheng利用FISH技术检测出在降解油脂类废水的厌氧反应器中甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)在颗粒中的含量要高于污泥絮体。Pereira等的研究发现,在处理优含油废水的厌氧反应系统中,为保证产甲烷细菌较高的生物活性,油酸的有机负荷率应保持在6kgoleate-COD·m-3d-1以下。3.3菌株组成和微生物多样性Batstone,张春杨[33～34]等一些学者对处理蛋白类废水进行了研究。张春杨通过构建16SrRNA基因文库,同时结合DGGE技术对豆腐废水UASB反应器中颗粒污泥的原核生物多样性进行了分析,并用MPN法对颗粒污泥中的互养产乙酸细菌和产甲烷菌进行了活菌数量测定。获得了代表25个菌种的58个克隆子,其中的19个(33%)属于古菌域,代表5种细菌,并且都与广古菌中的产甲烷菌关系密切,其中布氏甲烷杆菌(Methanobacteriumbryantii)丰度最高,其他4种分别与甲酸甲烷杆菌(Methanobacteriumformicicum),理事会甲烷鬃菌(Methanosaetaconcilii),梅氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)和小甲烷粒菌(Methanocorpusculumparvum)相近。对真细菌的研究发现大部分属于低GC革兰氏阳性细菌(占总克隆22%)代表6种细菌,其中2种与脂肪酸互养降解菌聚为一群,有3个种类与氨基酸单胞菌属(Aminomonas)、脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)和芽孢杆菌属(Bacillus)分别相近。δ变形菌(占总数9%),代表4种细菌,均与有机酸互养降解菌相近。其中一种与降解丙酸的互养杆菌属(Syntrophobacter)的序列相似,另外3种与氧化脂肪酸及芳香酸的史密斯氏菌属(Smithella)相似。同时检测到绿色非硫细菌的3个菌种。Batstone等研究发现蛋白颗粒污泥直径多在1.5mm左右,形状不规则,通过FISH技术显示出此中颗粒污泥中微生物活性较高、细菌含量大,甲烷鬃毛菌数量较多,贯穿于颗粒,有时出现在颗粒表面。甲烷八叠球菌科的种类几乎不会出现在颗粒外层。3.4细菌克隆及菲尔德变形制药废水中多以芳香类化合物含量居高。WuJinhui等[35～37]对处理对苯二酸盐的颗粒污泥进行了研究,FISH结果显示出其颗粒内真细菌和古细菌数量相当,而且没有明显的分层,可能是由于其颗粒粒径较小,在0.6mm左右,基质、营养和各级代谢产物较易流通的缘故。对颗粒中古细菌的研究,首先通过克隆及DGGE技术得到72克隆代表5种微生物。其中3种近似于甲烷鬃毛菌(Methanothrixconcili)占古细菌克隆的81.5%;另外2近似于甲烷微菌。对真细菌中δ亚纲变形细菌含量较高,占真细菌克隆的78.5%,共有10种细菌,其中有2种近似于互营细菌Syntrophus和Smithella,它们与降解芳香类化合物有关。真细菌中有1种含量较高的细菌值得一提,它近似于绿色非硫细菌(Greennonsulfurbacteria)的16SrRNA序列,据报道该群菌也普遍存在于其他反应器的颗粒污泥中,说明此种细菌的出现并非偶然,推测这群丝状的细菌在颗粒污泥中可能对形成和维系微生物聚集体的结构起作用,当然它们也具有降解大分子有机物的能力。4颗粒污泥中的产酸类真细菌和产甲烷类古细菌的群落组成和多样性处理不同类型废水的厌氧颗粒污泥中微生物群落结构与其代谢基质的性质有很大关系。(1)首先细菌层次形成受代谢类型影响并与颗粒直径相关。较大粒径的污泥颗粒(直径大于1.5mm),如较易降解的啤酒废水颗粒,产酸类真细菌和产甲烷类古细菌的层次较明显些。因为较大粒径的颗粒污泥内外物质交换阻碍较大,外层较易接触到基质原料,而细菌厌氧发酵由产酸发酵和产甲烷发酵两步相继完成,通常认为产酸发酵是限速步骤,所以流速缓慢而且稳定的中间介质流(如乙酸、氢气等)会提供给颗粒污泥内部,这样从营养基质上决定了产酸类真细菌在颗粒外层和产甲烷类古细菌在颗粒内层的分布趋势,而且颗粒内层会更好的保证厌氧环境,这样会更适合专性厌氧的产甲烷细菌的生长。而粒径较小的颗粒(直径小于1mm),如较难降解的制药废水颗粒,产酸类真细菌和产甲烷类古细菌无明显的分层现象。其基质、营养物质和各级代谢产物较易在颗粒各部分流通,导致其形成没有菌落层次的颗粒结构。(2)另外从前面的总结中可以看出各类颗粒污泥中微生物的种群多样性差异不是很大,但微生物种类、丰度各不相同。真细菌一般占总细菌的半数以上,其中互养产乙酸细菌在颗粒污泥中的数量较多。革兰氏阳性细菌和阴性细菌都有发现,革兰氏阴性细菌中δ亚纲的变型细菌常常出现,它们多为互养产乙酸细菌。而其各自又具有特异,例如处理对苯二酸盐废水中,有2种细菌近似于互营细菌(Syntrophus)和史密斯菌(Smithella),它们与氧化脂肪酸及芳香酸化合物有关;在含油废水颗粒中出现的互养杆菌属(Syntrophobacter)与降解短链脂肪酸有关;蛋白废水颗粒中含有与氨基酸降解相关的氨基酸单胞菌属