第22章-免疫学检测技术

第二十二章免疫学检测技术

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主讲：运晨霞第一节体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素一.体外抗原抗体反应的特征

高度特异性：抗原的表位与抗体的抗原结合点结构互补。

表面化学基团之间的可逆性结合适宜的抗原抗体浓度和比例抗原抗体反应的两个阶段高度专一性的结合可逆性结合Equivalence–Latticeformation抗原抗体比例对反应现象的影响抗原抗体反应的影响因素电解质：可促进抗原与抗体的结合。常用生理盐水。温度：最适温度为37℃。酸碱度：最适pH=6-8。第二节检测抗原或抗体的体外试验（一）凝集反应颗粒性抗原（RBC、细菌等）与相应抗体结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。1．直接凝集试验玻片凝集试验：用于定性测抗原。如ABO血型鉴定，细菌的鉴定、分型等。试管凝集试验：用于定量测抗体，如肥达氏反应。

2．间接凝集试验如类风湿因子的测定等。（二）沉淀反应

可溶性抗原（血清蛋白、组织浸液等）与相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故又称为琼脂扩散试验或免疫扩散。

琼脂凝胶1．单向免疫扩散用于定量测抗原。如检测血清免疫球蛋白、C3等含量。

2．双向免疫扩散主要用于定性检测抗原或抗体，抗原组成及两种抗原相关性分析3．免疫电泳

其方法是先电泳、后扩散。主要用于抗原成分的分析，亦可用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断

（三）免疫标记技术免疫标记技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术常用的标记物酶、荧光素、放射性核素、化学发光物质及胶体金优点：极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要类型：免疫酶技术免疫荧光技术放射免疫测定法发光免疫分析免疫胶体金技术1)免疫酶测定法（EnzymeImmunoassay,EIA）利用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原或抗体的方法特点：利用抗原-抗体反应的高度特异性，以及酶催化底物反应的生物放大作用,最后用酶标仪测定光密度值（OD），评定抗原-抗体的含量。常用酶及其底物辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）

分类双抗体夹心法在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等特点：非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇

间接法ELISA乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法2)免疫荧光技术

(ImmunofluorescenceTechnique)

用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法

常用荧光素异硫氰酸荧光素（FITC），显黄绿色。藻红蛋白（PE），显红色。用途：细胞表面CD分子抗核抗体

3)放射免疫测定法（RIA）用放射性核素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法敏感度可达pg水平，其标记物为125I、131I等。常用于微量物质的检测，如激素、IgE等。

4)发光免疫分析(luminescenceimmunoassay

LIA)将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量免疫分析技术。优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的高灵敏度。化学发光免疫测定吖啶酯、鲁米诺生物发光免疫测定萤火虫、发光水母化学发光酶免疫测定辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）电化学发光免疫测定5)免疫胶体金技术用胶体金标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法6)免疫印迹法（Westernblotting）该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫技术测定。常用于检测多种蛋白质免疫印迹法示意图4.蛋白质芯片技术：又称蛋白质微阵列是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA－蛋白质、RNA－蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。原理：是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表达数量。第三节免疫细胞功能的检测免疫细胞的分离外周血单个核细胞分离淋巴细胞的分离T细胞和B细胞的分离T细胞亚群的分离(一)外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。

Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞密度不同人的红细胞密度为1.093

粒细胞密度为1.092

单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090

用1.077±0.001的分层液可将细胞分离密度梯度离心(Ficoll)离心（二）淋巴细胞及其亚群的分离和分析免疫吸附分离法免疫磁珠法荧光激活细胞分离仪分离法（

(FluorescenceActivatedCellSorting)，

FACS

）抗原肽-MHC分子四聚体技术分析CTL

2.免疫磁珠细胞分离免疫磁珠法细胞分选过程3.荧光激活细胞分离仪分离法流式细胞术(flowcytometry,FCM)

全自动细胞分选系统流式细胞分析仪流式细胞仪的工作原理和基本结构待测细胞以单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色，放入样品管，吸入流动室。流动室充满IsoFlow

，作用：约束样品在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。4.抗原肽-MHC分子四聚体是一种药品的名字，可应用于免疫学研究和检测、特异性免疫治疗以及疫苗疗效监测等多个方面抗原肽-MHC分子四聚体技术分析CTL二细胞免疫功能检测T细胞功能测定B细胞功能测定（1）T淋巴细胞增殖试验原理：淋巴细胞DNA合成分化母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松1）形态学检查法2）3H-TdR掺入法优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。3H-TdR或125I-UdR掺入法3）MTT比色法(2)迟发型超敏反应检测2.B细胞功能测定单扩ELISA速率比浊法测定各类免疫球蛋白含量抗体形成细胞测定（2）溶血空斑试验原理：临床应用与评价溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。

B细胞抗体形成功能的检测

——酶联免疫斑点法原理：应用与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。ELISPOT技术简介

酶联免疫斑点试验(Enzymelinkedimmunospotassay)

80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。ELISPOT的基本原理

细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与酶标记（例如碱性磷酸酶）的亲和素结合。底物（BCIP/NBT，产物为蓝紫色）孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过酶联斑点分析系统对斑点分析后得出结果。稳定、特异，且抗原用量少可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量