第四章 基因工程

10/18/20231GEHBGULAM第四章

基因工程载体vectors10/18/20232GEHBGULAM10/18/20233GEHBGULAM在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。1.载体

（Vectors）10/18/20234GEHBGULAM

（1）在宿主细胞内能独立复制。

（2）有选择性标记。（3）有一段多克隆位点。2.基因工程对载体

的要求外源DNA插入其中不影响载体的复制。（4）分子量小，拷贝数多。（5）容易从宿主细胞中分离纯化。10/18/20235GEHBGULAM

基因工程中常用的载体(来源)有5类：

3.载体的种类质粒（plasmid）单链DNA噬菌体M13

噬菌体的衍生物柯斯质粒（cosmid）

动物病毒（virus）

10/18/20236GEHBGULAM功能克隆载体:

克隆一个基因或DNA片断表达载体:

用于一个基因的蛋白表达整合载体:

把一个基因插入到染色体组中10/18/20237GEHBGULAM质粒*受体细胞结构插入片断举例E.coli环状〈8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，Λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状〈10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体〉1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒载体的种类和特征10/18/20238GEHBGULAM第一节

质粒载体

一、质粒（plasmid）

是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。10/18/20239GEHBGULAM大肠杆菌的质粒10/18/202310GEHBGULAM克隆的质粒载体允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体允许外源DNA的插入、储存和表达。10/18/202311GEHBGULAM（1）分子小1.质粒的一般生物学特性1—200kb（2）编码基因少2—3个中等大小的蛋白质。（3）环形状双链环状DNA。（酵母的“杀伤质粒”是RNA）。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。10/18/202312GEHBGULAM（4）质粒的空间构型①共价闭合环状DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）CovalentclosecircularDNA10/18/202313GEHBGULAM③线形DNA（

linear，lDNA）一条链上有一至数个缺口。②开环DNA（

opencircular，ocDNA）10/18/202314GEHBGULAM（5）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL10/18/202315GEHBGULAMLOCSC10/18/202316GEHBGULAM二、质粒的类型在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒:非接合型质粒能自我转移不能自我转移10/18/202317GEHBGULAM除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒、或F因子）：甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。又叫自我转移型质粒。1.接合型质粒：不符合基因工程的安全要求。10/18/202318GEHBGULAM大肠杆菌接合（conjunction）10/18/202319GEHBGULAM2.非接合型质粒虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。（1）R质粒（抗性质粒）带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。符合基因工程的安全要求。10/18/202320GEHBGULAM10/18/202321GEHBGULAM带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。（2）Col质粒大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。10/18/202322GEHBGULAM三、质粒的复制类型1.严紧型质粒（stringentplasmid）拷贝数少，只有1—3份拷贝。2.松弛型质粒（relaxedplasmid）拷贝数多，有10—60份拷贝。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。10/18/202323GEHBGULAM（1）分子量大，拷贝数低四、质粒载体的构建1.天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长

9.1kb。但只有一个EcoRI切点充当克隆位点，Tetr作为筛选标志。10/18/202324GEHBGULAM10/18/202325GEHBGULAMColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）。（2）筛选标志不理想可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicinE1的细胞…….colicinE1能杀死不含ColE1质粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部。10/18/202326GEHBGULAMColE110/18/202327GEHBGULAM（1）

具有复制起点（ORI）2.质粒载体必须具备的基本条件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性内切酶的单一位点是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。10/18/202328GEHBGULAM（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。10/18/202329GEHBGULAMAtypicalplasmidvector.

Itcontainsapolylinkerwhichcanrecognizeseveraldifferentrestrictionenzymes,anampicillin-resistancegene(ampr)forselectiveamplification,andareplicationorigin(ORI)forproliferationinthehostcell.

10/18/202330GEHBGULAM氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性

（Kanr）四环素抗性

（Tetr）链霉素抗性

（Strr）氯霉素抗性

（Cmlr）3.质粒的选择标记及其工作原理（1）选择标记①抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：10/18/202331GEHBGULAM

常用抗菌素的抗性工作原理i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。a）抑菌原理b）细菌抗性原理Ampr基因编码

-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的

-内酰胺环。10/18/202332GEHBGULAMii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。b）细菌抗性原理Cmlr

编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。a）抑菌原理10/18/202333GEHBGULAMa）杀菌原理iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌。b）细菌抗性原理Kanr

编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。10/18/202334GEHBGULAMiv）链霉素（Streptomycin，Str）a）杀菌原理通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌。b）细菌抗性原理Strr

编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。10/18/202335GEHBGULAMv）四环素（Tetracycline，Tet）b）细菌抗性原理a）抑菌原理通过与30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。Tetr编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。10/18/202336GEHBGULAM10/18/202337GEHBGULAM10/18/202338GEHBGULAM②

遗传标记使受体菌发生遗传性状的改变的基因。10/18/202339GEHBGULAM10/18/202340GEHBGULAM当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。（2）抗菌素选择原理活死抗性基因抗菌素10/18/202341GEHBGULAM4.人工构建的质粒载体的类型（1）高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数1000—3000个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。10/18/202342GEHBGULAM（2）低拷贝数的质粒载体

但有特殊用途:由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。pLG338、pLG339、pHSG415等不适合大量扩增DNA用。10/18/202343GEHBGULAM（3）失控的质粒载体这是一类温度敏感型复制控制质粒。温度低（低于37oC），拷贝数很少；温度增加（>40oC）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。如pBEU1、pBEU2。runawayplasmidvectors1979年B.E.Uhlin等构建。10/18/202344GEHBGULAM（4）

插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、pBR329。抗菌素抗性外源DNA无抗菌素抗性10/18/202345GEHBGULAM（5）正选择的质粒载体如pUR2、pTR262等。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。直接选择转化后的细胞。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。Directselectionvectors10/18/202346GEHBGULAM（6）

表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。10/18/202347GEHBGULAM复制起始点ORI、选择标记、多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因I操纵基因O启动基因P核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区。1）普通载体元件①表达载体的结构10/18/202348GEHBGULAM10/18/202349GEHBGULAM五、经典的大肠杆菌质粒载体1.pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。（1）类型天然质粒，属低拷贝型。（2）长度9.09kb。（3）选择标记四环素抗性Tetr10/18/202350GEHBGULAM6个克隆位点：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3个位于选择标记Tetr的内部）（4）克隆位点10/18/202351GEHBGULAM10/18/202352GEHBGULAM2.ColE1（1）类型天然质粒，属高拷贝型。（2）长度6.3kb。（3）选择标记大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞1000-3000拷贝之多！10/18/202353GEHBGULAM①colicinE1基因的结构ceaimmkil结构基因免疫基因溶菌基因②杀死不含有ColE1细菌的原因cea+kil基因产物③

不被其他细菌的colicinE1所杀死的原因imm基因10/18/202354GEHBGULAMEcoRI位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）。EcoRI（4）克隆位点ColicinE1外源DNA无Colicin10/18/202355GEHBGULAM用对外源colicinE1的免疫性和自身不能合成colicinE1作选择，操作非常繁杂。对colicinE1敏感的细菌群体中自发突变产生抗colicinE1的频率很高！（5）ColE1的选择缺陷ColE1抗colicinE1杀ColE1-仍抗colicinE1不杀ColE1-插入片断ColE110/18/202356GEHBGULAM10/18/202357GEHBGULAMpSP2124质粒的Ampr基因3.pBR322：（1）元件来源F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。①复制起点

oripMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。10/18/202358GEHBGULAM（2）长度4363bp（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点其中9个会导致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3个会导致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24个克隆位点。10/18/202359GEHBGULAM10/18/202360GEHBGULAM（5）pBR322的优点①双抗菌素抗性选择标记

插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞

在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。10/18/202361GEHBGULAM外源基因

BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因

PstITet中存活但在Amp中死亡10/18/202362GEHBGULAM氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。③

高拷贝数②分子小，克隆能力大载体越小越好。>10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。10/18/202363GEHBGULAM保留了转移蛋白（mob）的作用位点。（6）pBR322的缺点能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！10/18/202364GEHBGULAM①删除mob识别位点（如质粒pBR327、pAT153等）。pAT153：从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。（7）PBR322的改进10/18/202365GEHBGULAMpBR325：在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也带一个EcoRI位点。使EcoRI也成为插入失活型位点。②

改造EcoRI位点10/18/202366GEHBGULAM4.pUC系列UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC1910/18/202367GEHBGULAM①

复制起点pBR322的

ori但其上失去了克隆位点。②

Ampr基因（1）元件来源③lacZ的启动子大肠杆菌④lacZ’基因大肠杆菌lacZ的

-肽链序列，

是LacZ的氨基端片断。pBR322的Ampr基因10/18/202368GEHBGULAM（2）长度约2.7kb（3）克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。10/18/202369GEHBGULAMpUC18/1910/18/202370GEHBGULAM10/18/202371GEHBGULAMAmpicillin抗性和lacZ的

肽互补（蓝白斑）相结合。（4）选择标记蓝白斑选择原理：①Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-

-D-galactoside）10/18/202372GEHBGULAM

-半乳糖苷酶能把无色的化合物X－gal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。X－gal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝

-半乳糖苷酶②

-半乳糖苷酶X-gal显色反应：10/18/202373GEHBGULAM③lacZ的

肽互补1）

-肽（

lacZ’

）：

-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.C端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aa4聚体10/18/202374GEHBGULAM2）受体菌lacZ突变（lacZ∆M15）受体菌基因组的

-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失

肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解X－gal受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a10/18/202375GEHBGULAMpUC质粒载体上的lacZ’

编码

肽与这个缺失突变的

-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解X－gal。产生蓝色物质。C端大部分N端的11-41aapUClacZ’

受体菌lacZ∆3）载体lacZ’与

互补10/18/202376GEHBGULAM4）

互补的插入失活pUC载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。lacZ’

5’

3’

肽移码突变lacZ’

5’

3’

肽不互补互补MCS外源DNA10/18/202377GEHBGULAM④IPTG的诱导作用IPTG(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside)是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’

肽都表达。从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生

肽！IPTG10/18/202378GEHBGULAM通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。IPTG诱导的结果：10/18/202379GEHBGULAM无质粒的受体菌

-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；无抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养无菌斑生长质粒转化的受体菌

-半乳糖苷酶的缺失被载体产物

互补，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有蓝色菌斑生长带外源DNA插入的质粒转化的受体菌载体产物失活，不能互补

-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有白色菌斑生长10/18/202380GEHBGULAM10/18/202381GEHBGULAM（5）pUC系列载体的优点①更小的分子量：如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。②选择方便X-gal显色、抗菌素双重直接选择。③克隆便利具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。④测序方便10/18/202382GEHBGULAMpUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。M13mp18的多克隆位点10/18/202383GEHBGULAM六、其它质粒载体1.pGEM-3Z由pUC派生而来。与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。T7启动子SP6启动子MCSlacZ’

Amprori可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录。10/18/202384GEHBGULAM①

如果加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA②外源基因正接反接都可以转录。③MCS与pUC18的完全一样。2.pGEM-4Z：与pGEM-3Z相同，只是T7启动子和SP6启动子的位置互换。（1）pGEM-3Z的特点：10/18/202385GEHBGULAM3.穿梭质粒载体（1）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。（shuttleplasmidvectors）10/18/202386GEHBGULAMYeast复制起点E.coli复制起点E.coli选择标记Yeast选择标记MCS大肠杆菌

枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌

酿酒酵母穿梭载体

大肠杆菌

动物细胞穿梭载体（2）常用的穿梭质粒载体10/18/202387GEHBGULAM（3）穿梭载体的优点②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。克隆、构建表达E.coliAnimalcell①

利用大肠杆菌进行基因克隆、表达10/18/202388GEHBGULAM10/18/202389GEHBGULAM10/18/202390GEHBGULAM七、质粒载体的不稳定性1.质粒稳定遗传必须的两个条件：（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分

配到两个子细胞中。10/18/202391GEHBGULAM有主动分配和随机分配两种假说。（1）主动分配天然质粒。2.质粒分配方式具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（Par），能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中。10/18/202392GEHBGULAM人工构建的质粒载体缺失了par区，只能以随机分配方式分到子细胞中。人工质粒。（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（2）随机分配但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。10/18/202393GEHBGULAM在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。3.分离的不稳定性（segregationinstability）10/18/202394GEHBGULAM4.结构的不稳定性（structuralinstability）寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。ISdimer重组10/18/202395GEHBGULAM（1）新陈代谢负荷：5.影响质粒载体稳定性的主要因素使寄主细胞生长减缓：质粒载体使寄主的世代时间延长约15%。①复制负荷减缓的程度与质粒的分子量成正比。②转录和翻译负荷丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！10/18/202396GEHBGULAM每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同，称差度。（2）质粒载体的拷贝数低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。差度（variance）：是产生无质粒细胞的重要原因。高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。10/18/202397GEHBGULAM野生型E.coli中，质粒在寄主的重组酶作用下会发生重组形成二聚体质粒。（3）寄主菌的重组体系二聚体灾难（dimercatastrophe）：含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控。10/18/202398GEHBGULAM第二节

噬菌体载体

噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）。一、噬菌体的一般特性结构：蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。10/18/202399GEHBGULAM10/18/2023100GEHBGULAMsinglelinearDNA(about182,000bp)T2GenomicDNA10/18/2023101GEHBGULAMT4Bacteriophage10/18/2023102GEHBGULAM分为两种：1.溶菌周期二、噬菌体的生活周期感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。烈性噬菌体（virulentphage)10/18/2023103GEHBGULAM10/18/2023104GEHBGULAM10/18/2023105GEHBGULAM2.溶原周期感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。温和噬菌体（temperatephage)原噬菌体（prophage)：10/18/2023106GEHBGULAM10/18/2023107GEHBGULAM三、单链噬菌体载体

M13、f1、fd噬菌体单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：M13噬菌体10/18/2023108GEHBGULAM（2）复制型（RF）是双链环状DNA。1.单链DNA噬菌体的特点（3）RFDNA和ssDNA都能转染感受态

大肠杆菌。并产生噬菌斑。（5）可产生大量的含有外源DNA插入片

断的单链分子，便于作探针或测序。（1）+DNA。（ssDNA）（4）不存在包装限制。10/18/2023109GEHBGULAM2.M13噬菌体RFdsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。成熟的噬菌体里只包装有+DNA，也容易提取。M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌。但M13DNA可以转染雌性大肠杆菌。6407bp。（2）DNA长度（3）DNA提纯（1）寄主10/18/2023110GEHBGULAMM13序列10/18/2023111GEHBGULAM（4）M13的生活周期虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的1/2—3/4）M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA+DNA合成－DNA，形成RFdsDNA－DNA转录mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞10/18/2023112GEHBGULAM+DNA-DNAmRNAM13外壳蛋白组装成子代M13+DNA注入大肠杆菌复制转录翻译+DNA指导合成+DNA200个RFDNA每个细胞可以放出约1000个M13颗粒！10/18/2023113GEHBGULAMM13的包装过程：RFdsDNA指导合成的+DNAM13基因V编码单链DNA结合蛋白DNA-蛋白质复合物转移到寄主的细胞膜M13外壳蛋白基因V蛋白脱落+DNA溢出细胞膜包装（5）没有包装限制10/18/2023114GEHBGULAM3.M13载体的构建：M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。（1）克隆区域的选定①基因间隔区（intergenicregion,IG区）IG区内只有一个

BsuI切点。其余9个BsuI限制性位点分布在其它部位。②酶切位点10/18/2023115GEHBGULAMM13J.Messing证明，IG区存在M13的复制起点，但可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力。10/18/2023116GEHBGULAM在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（

-肽序列)。利用

-肽序列中的三个单一酶切位点（BglII、AvaII和

PvuI）。（2）加入酶切位点①

在IG区内加入单一内切酶位点第一个M13载体：M13mp1：10/18/2023117GEHBGULAMM13RFBsuI不完全消化各种长度的线性片断（其中应有只在IG上切开的线性全长M13）E.coli

lac基因的HindII片断(lacI、lacP、lacO、lacZ’）连接M13mp1JM101宿主只有在IG区插入lacZ’才能存活并在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑10/18/2023118GEHBGULAM（3）M13载体系列加上常用的酶切位点。①M13载体系列的命名M13mpn

n代表系列数字②

对M13mp1的改进B.Gronenborn和J.Messing1978年把LacZ’5’端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoRI切点。M13mp2：10/18/2023119GEHBGULAM5’ATGACCATGATTACGGATTCA-Me用N-甲基-N-亚硝基脲

把G甲基化

5’ATGACCATGATTACGGATTCA-转染E.coli。mG与T配对，复制两次后5’ATGACCATGATTACGAATTCA-EcoRI切点用EcoRI切M13mp1M13mp2选择能切开的

线性分子再环化M13mp110/18/2023120GEHBGULAM③

对M13mp2的进一步改进在M13mp2的LacZ’的5’端加上一段人工合成的多克隆位点（MCS）。M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19对应有相同MCS的pUC系列载体：pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19成为M13mp系列载体：10/18/2023121GEHBGULAM10/18/2023122GEHBGULAM10/18/2023123GEHBGULAM与pUC18相同M13mp18的多克隆位点10/18/2023124GEHBGULAM4.M13系列载体的优点（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2）Xgal显色反应，可供直接选择（3）无包装限制，克隆能力大（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA。10/18/2023125GEHBGULAMMCS+-+-+-编码链非编码链外源DNA不同的酶切不同的酶切插入M13vector10/18/2023126GEHBGULAMM13RF+-+-+-外源DNA转染E.coli成熟的子代M13中++10/18/2023127GEHBGULAMPhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolIII±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.10/18/2023128GEHBGULAM①

插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降②实际克隆能力小于1500bp。虽无包装限制，并非无限包装！5.M13载体的缺点10/18/2023129GEHBGULAM6.噬菌粒载体（phagemidvectors）由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。MCS噬菌体ori质粒oriAmprlacZ’

lacI10/18/2023130GEHBGULAM约3000bp（比M13小）②克隆能力大能插入10kb的外源DNA。③两种复制形式①分子量小（1）噬菌粒载体的特点既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。10/18/2023131GEHBGULAM（2）常见的噬菌粒载体噬菌粒载体质粒部分单链噬菌体部分辅助噬菌体大肠杆菌寄主pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101

VXM13M13变异株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL1-Blue辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体。10/18/2023132GEHBGULAM（3）pUC118/pUC119①构成1）M13的基因间隔区（IG）2）pUC18/pUC19质粒载体：带有M13复制起点。质粒复制起点Ampr

lacZ’

MCS10/18/2023133GEHBGULAMMCSpUC18/pUC19oriAmprlacZ’

lacIM13ori3.2kbpUC118/11910/18/2023134GEHBGULAM②pUC118/119的复制模式两种不同的复制模式1）双链质粒复制模式受pUC本身的复制起点（来源于ColE1）的控制。每个细胞能达到500个拷贝。10/18/2023135GEHBGULAM来源于M13的复制起点被辅助噬菌体的基因II产物控制。2）单链滚环噬菌体复制模式外壳蛋白复制蛋白辅助M13包装当寄主细胞被辅助噬菌体M13感染后。10/18/2023136GEHBGULAM③噬菌粒载体的包装1）辅助噬菌体：自身的复制起点发生了突变，复制效率低下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白和复制蛋白，帮助噬菌粒载体复制。如M13K07等。2）包装：辅助噬菌体外壳蛋白和复制蛋白噬菌粒载体ssDNA噬菌体10/18/2023137GEHBGULAM（4）pBluescript噬菌粒载体（pBS）Stratagene公司发展的一类噬菌粒载体。由pUC质粒载体、f1噬菌体的复制起点和T3、T7噬菌体的启动子组成。②特点①组成MCS两侧分别加上T3和T7噬菌体的启动子。加入适当的噬菌体RNA聚合酶，就可以定向体外转录。1）定向体外转录10/18/2023138GEHBGULAM2）两种复制模式既能以质粒的形式复制，又能以噬菌体的形式复制包装。3）选择方便有Ampr和lacZ’，可以进行Amp抗性选择和Xgal-IPTG蓝白斑选择。4）插入方便18个单一酶切位点的MCS10/18/2023139GEHBGULAMSK：表示lacZ’的转录方向是沿MCS上的

SacI

KpnI

+（f1+）：单链复制起始方向背离

lacZ’，能回收lacZ’的编码链（+）pBluescriptSK（+/-）/pBluescriptKS（+/-）KS：反向（

KpnI

SacI，MCS相反）-（f1-）：能回收lacZ’的非编码链（-）1）pBluescriptSK/KS（+/-）区分：③

常用的pBluescript载体10/18/2023140GEHBGULAMpBSSK+10/18/2023141GEHBGULAMpBSKS-10/18/2023142GEHBGULAM10/18/2023143GEHBGULAM10/18/2023144GEHBGULAM（5）PCR产物克隆载体T载体pCR系列载体Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。①结构pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性。MCS的中部已经切开，各有一个3’端突出的T。②特点PCR产物往往在3’端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。10/18/2023145GEHBGULAMpCR2.110/18/2023146GEHBGULAMpCR2.1的MCS克隆的PCR产物能被两侧的EcoRI切下来回收。10/18/2023147GEHBGULAMpCR2.1-topo10/18/2023148GEHBGULAMpCR100010/18/2023149GEHBGULAMPromega公司的T载体系列pGEM-Tvector10/18/2023150GEHBGULAMpTargetvectorG418抗性可在真核生物表达外显子捕捉10/18/2023151GEHBGULAMTvector的克隆过程——简便！AATTTvectorPCRproductT4DNAligaseAA10/18/2023152GEHBGULAM7.噬菌体展示载体（

Phagedisplayvector）（1）噬菌体展示（Phagedisplay）将外源蛋白（多肽、酶、抗体、DNA结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于噬菌体的外表面。G.P.Smith1985年发明。丝状噬菌体（M13、f1等）外壳颗粒的一端，有3-5个基因Ⅲ编码的蛋白质（g3p），在识别和吸附大肠杆菌的过程中起作用。10/18/2023153GEHBGULAMM1310/18/2023154GEHBGULAM（2）噬菌体展示载体的构建把外源DNA片断插入基因Ⅲ的序列前端，并保持两者的阅读框正确，表达出融合蛋白。启动子外源DNAM13基因ⅢoriM13displayvector外源多肽10/18/2023155GEHBGULAM四、双链噬菌体载体—

载体（1）长度为48502bp；（2）双链线性DNA；（3）但在两端有cos位点，可以环化。

DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。1.

DNA分子的特点

cos位点（cohensive-endsite）10/18/2023156GEHBGULAM

DNA进入细菌体内后，可形成双链环状DNA复制型（RFDNA）。10/18/2023157GEHBGULAM

噬菌体和其DNA10/18/2023158GEHBGULAMDNA上有至少61个基因，有一半是必须的与自身的活动有关，成簇排列。其他约1/3是非必须基因（位于尾部合成至阻遏之间的区段）。2.

噬菌体的基因组特点

10/18/2023159GEHBGULAM

genome(48502bp)10/18/2023160GEHBGULAM10/18/2023161GEHBGULAM

噬菌体感染细菌的早期：双链进行

型复制。3.

DNA的复制

模型（1）

型复制10/18/2023162GEHBGULAM（2）滚环复制

感染的晚期：启动滚环复制机制。形成多联体

DAN分子。10/18/2023163GEHBGULAM这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。10/18/2023164GEHBGULAM（1）构建原理4.

噬菌体载体的构建（2）构建过程①在这个非必须区内制造限制酶切点②引进某些突变表型，作为选择标记③突变某些基因，使它成为安全载体④删除

DNA必须区段上常用的限制酶切点

噬菌体DNA上本身有5个EcoRI和7个HindIII切点！删除

噬菌体的非必需区，留出插入空间。10/18/2023165GEHBGULAM（3）人工构建的

噬菌体载体有两种类型①插入型载体（insertionvectors)如

gt10、

gt11、

BV2、

NM540、

NM1590、

NM6071）免疫功能失活型：插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内。EcoRIcI

gt1010/18/2023166GEHBGULAM插入导致载体不能合成阻遏物，

载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。没有外源DNA插入的

载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。选择标记:如

NM1149载体的两个克隆位点（EcoRI和HindIII）都是位于cI基因内部。10/18/2023167GEHBGULAM2）

-半乳糖苷酶失活型载体在

基因组中引入了LacZ’序列。（其上含有一个EcoRI克隆位点）。感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用Xgal的显色反应作选择标记。LacZ’

EcoRICharon16A选择标记:10/18/2023168GEHBGULAM②

替换型载体（substitutionvectors)

两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于

DNA的非必须区两端。用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片断置换。可置换区MCSMCS如：

EMBL4、Charon40等。10/18/2023169GEHBGULAM1）

EMBL4

EMBL4的可置换片断内部还有SalI酶切位点。以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。左臂可置换区右臂EcoRIBamHISalISalIBamHIEcoRISalISalI

EMBL410/18/2023170GEHBGULAM2）Charon40Charon40的可置换片断是由DNA短片重复构成，片断之间有HaeI切点。在克隆的时候，可以用HaeI酶进一步将可置换片断切成小片断，以防止重新与载体连接。左臂可置换区右臂MCSMCSCharon40HaeI10/18/2023171GEHBGULAM可取代片断中如果包含LacZ’，可用Xgal显色作筛选标记。（4）

载体的筛选标记②插入型载体根据插入所引起的表型突变。①置换型载体10/18/2023172GEHBGULAM

Virusesthatcaninfectbacteria.48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)λphageLyticphase

(Replicateandrelease)Lysogenicphase(integrateintohostgenome)10/18/2023173GEHBGULAM

载体克隆策略置换型载体10/18/2023174GEHBGULAM

DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。5.

载体的体外包装

在试管中与

噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入受体菌中。必须利用噬菌体外壳的作用！（1）体外包装10/18/2023175GEHBGULAM

10/18/2023176GEHBGULAM

的D基因的产物也是头部蛋白，但主要与

DNA进入头部和头部的成熟有关（只占20%）。（2）体外包装过程①

噬菌体外壳蛋白的合成E基因的E基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的70%）。D基因10/18/2023177GEHBGULAME基因突变只合成尾部蛋白和包装识别蛋白D基因突变合成头部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包装DNA提取尾部蛋白提取头部和尾部蛋白重组的

载体DNA体外包装成活性噬菌体10/18/2023178GEHBGULAM外源的重组

DNA载体被诱发与内源性原

DNA发生重组。（3）体外包装存在的问题①包装错误既能包装用于生产头部蛋白的内源性原

DNA，也能包装重组的

DNA载体。②重组10/18/2023179GEHBGULAM③体外包装的容量限制必须在正常野生型容量的75%—105%（36—51kb）之间。既不能超过正常野生型容量的105%；又不能低于正常野生型容量的75%野生型

DNA的必须区是28kb，所以

载体的最大克隆容量是23kb。（实际上为15kb）。10/18/2023180GEHBGULAM比一般的质粒载体的容量大的多（4）

DNA载体的优点用在真核生物基因组文库的建立。Sau3ABamHI10/18/2023181GEHBGULAM10/18/2023182GEHBGULAM噬菌体感染细菌形成的噬菌斑10/18/2023183GEHBGULAM1978年J.Collins和B.Hohn等人发展出cosmidvector（cossite-carryingplasmid)

DNA：4—6kb（1）大小

（2）组成

6.cosmid载体（粘粒）cos序列和控制包装的的序列。pBR322：质粒的复制子抗药性基因几个限制性酶的单一位点10/18/2023184GEHBGULAM柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体λ的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb10/18/2023185GEHBGULAMCloningbyusingcosmidvectors.

(a)Inadditiontoampr,ORI,andpolylinkerasintheplasmidvector,thecosmidvectoralsocontains

aCOSsite.

(b)Aftercosmidvectorsarecleavedwithrestrictionenzyme,theyareligatedwithDNAfragments.

Thesubsequentassemblyandtransformationstepsarethesameascloningwithlphages10/18/2023186GEHBGULAM①具有

噬菌体的特性（3）cosmidvector的特点

克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒。在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌

）。②具有质粒载体的特性大多带有pMB1或ColE1的复制子，能象质粒一样复制。10/18/2023187GEHBGULAM有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。③方便的选择④高容量的克隆能力45kb

（最少不能低于30kb）。51kb-5kb=45kb10/18/2023188GEHBGULAM（4）部分cosmidvectorCosmid载体复制子大小（kb)选择标记克隆位点克隆能力（kb)c2XBpMB16.8Ampr,Kanr

BamHI,ClaI,EcoRI,HindIII,PstI,SmaI32~45pHC79pMB16.4Ampr,Tetr

EcoRI,HindIII,SalI,BamHI,PstI,CalI29~46pHS262ColE12.8Kanr

BamHI,EcoRI,HincII34~50pJC74ColE115.8Ampr

EcoRI,BamHI,BglII,SalI21~37pJC75-58ColE111.4AmprEcoRI,BamHI,BglII16~42pJC74mColE121Ampr,KanrBamHI16~32pJC720ColE17.1Elimm,Rifr

HindIII,XmaI11~2810/18/2023189GEHBGULAMCosmid载体复制子大小（kb)选择标记克隆位点克隆能力（kb)pJC81pMB17.1Ampr,TetrKpnI,BamHI,HindIII,SalI30~46pJB8ColE15.4Ampr

BamHI,HindIII,SalI31~47MuA-3pMB14.8TetrPstI,EcoRI,BalI,PvuI,PvuII32~48MuA-10pMB14.8TetrEcoRI,BalI,PvuI,PvuI32~48pTL5pMB15.6TetrBglII,BalI,HpaI31~47pMF7pMB15.4Ampr

EcoRI,SalI32~4810/18/2023190GEHBGULAM应用cosmid载体在大肠杆菌中克隆大片端的真核基因组DNA技术，叫“柯斯克隆”（cosmidcloning）。（5）cosmidcloning①理论依据cos位点:

噬菌体的生命周期中，会产生数百个

DNA通过cos位点连接的“多联体”分子。“多联体”复制：包装识别。10/18/2023191GEHBGULAM在包装的时候，

噬菌体具有位点特异的末端酶（terminase）体系（Ter体系），识别cos位点，把多联体切成单个

DNA长度。两个cos位点之间，必须保持38—45kb的DNA，Ter体系才能识别。Ter体系包装限制10/18/2023192GEHBGULAM①用特定的核酸内切酶消化真核生物DNA（6）cosmid克隆的一般过程②用同样的内切酶消化cosmid载体产物中将有一定比例的分子是两端各有一个cos位点、长度40kb左右的真核DNA与载体的连接物。③连接10/18/2023193GEHBGULAM切割合适长度的杂种DNA连接物，并包装入噬菌体头部。注入到细菌体内的杂种DNA分子环化，并按质粒的方式复制。⑤感染大肠杆菌④Ter体系识别并切割10/18/2023194GEHBGULAM10/18/2023195GEHBGULAM10/18/2023196GEHBGULAM大质粒！10/18/2023197GEHBGULAM①载体片断自我连接②外源DNA片断自我连接③多个本来不在一起的外源DNA片断连接起来同时插入载体（7）cosmid载体克隆的缺点用碱性磷酸酶除去线性质粒片断5’端的磷酸，可防止载体自体连接。克服载体自体连接的改良方案：10/18/2023198GEHBGULAM①Ish-Horowice—Burke改良方案1981年，D.Ish-Horowice和J.F.Burke。（8）cosmid载体的改良在BamHI位点两侧各有一个EcoRI切点。1）突出的特点：pJB8cosmid载体使克隆在BamHI上的外源DNA可被EcoRI切下来。10/18/2023199GEHBGULAM包装识别10/18/2023200GEHBGULAM2）Ish-Horowice—Burke方案克隆过程HindIIISalISalIHindIIIBamHI10/18/2023201GEHBGULAMa.需要脱磷酸化处理。b.电泳纯化载体两臂。c.载体两臂的最终得率少的可怜！2）Ish-Horowice—Burke方案的缺点防止载体自我连接第二次酶切后。10/18/2023202GEHBGULAM1983年P.F.Bates和R.A.Swift②Bates---Swift改良方案a.具有两个cos位点。SmaI平端的连接效率低，阻止了载体臂的自我连接，增加了外源DNA的连接效率。1）特点：b.一个SmaI切点把两个cos位点分开。c.BamHI克隆位点。c2XBcosmid载体10/18/2023203GEHBGULAM10/18/2023204GEHBGULAMBates---Swift克隆过程：10/18/2023205GEHBGULAM第三节

大分子DNA克隆载体A.W.Murray1983年形成基础理论,D.T.Burke等1987年变为现实。一、酵母人工染色体1.YAC的特点（1）只能在酵母细胞中扩增（yeastartificialchromosome,YAC)（2）克隆容量大，为230kb-1700kb（3）构建原理，按染色体结构构建10/18/2023206GEHBGULAM（1）DNA复制起始点（ori）2.染色体复制和遗传的三个基本组件TELTELCENORI（2）着丝粒（centromere，cen）（3）两个端粒（telomeres，tel）10/18/2023207GEHBGULAMLeuARSCENLeu-Yeast后代死Leu-Yeast80%后代死Leu-Yeast后代活Leu-Yeast后代死Leu-Yeast后代活TelTel10/18/2023208GEHBGULAM（1）着丝粒区（CEN）A

AGTCACGTGTTGTTTCTGNTTTCCGAAA3.YAC的组成结构酵母染色体着丝粒区的保守序列:78-86bpIIIIII由三个区组成10/18/2023209GEHBGULAM酵母第3、4、6、11号染色体的着丝粒区序列：10/18/2023210GEHBGULAM酵母端粒保守序列是(G4T2)n

重复序列。（3）复制起点（ORI）约100bp的自主复制序列（ARS）。（2）端粒（TEL）人是TTAGGG重复序列;四膜虫是GGGTTG重复序列。（真核生物中只有酵母菌有ARS）两个端粒序列Tel。10/18/2023211GEHBGULAM位于

SUP4

基因内部。（4）克隆位点插入失活选择SUP4酶失活的酵母菌落呈红色；不失活的菌落是白色。10/18/2023212GEH