第一章 酶的基础知识2

酶工程

Enzymeengineering

绪论第一章

酶的基础知识第二章

微生物酶发酵产酶第四章

酶的分离纯化第五章

酶的分子修饰第六章

酶和细胞的固定化第七章酶的非水相催化第八章酶的应用第一篇酶学理论第二篇酶工程第一节

酶学概论一、酶的概念及其作用特点二、酶的化学本质及其组成三、单体酶、寡聚酶、多酶复合体、多酶融合体四、酶的命名及分类五、酶的活力测定第一章

酶的基础知识第一节酶学概论第二节酶的作用机理第三节酶促反应动力学第二节

酶的作用机理

一

、酶的活性中心

二、

酶的专一性的机理

三、

高效性的机理一

、酶的活性中心1.酶活性中心的概念2.酶活性中心的结构特点3.研究酶活性中心的方法1、活性中心的概念活性中心：酶分子中结合底物并起催化作用的少数氨基酸残基，包括底物结合部位、催化部位一

、

酶的活性中心①结合部位（Bindingsite）：

指酶分子中与底物结合的部位或区域。底物靠许多弱键与酶结合。此部位决定酶的专一性②催化部位（catalyticsite）：

指酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位，底物的键在此被打断或形成新的键。此部位决定酶的催化能力和反应的性质。2.酶活性中心的结构特点（1）活性中心只占酶分子总体积的很小一部分，往往只占整个酶分子体积的1%-2%。

某些酶活性部位的AA残基酶AA残基数活性部位的AA残基核糖核酸酶124

His12,His119,Lys41溶菌酶129Asp52,Glu35胰凝乳蛋白酶241His57,Asp102,Ser195胃蛋白酶348Asp32,Asp215木瓜蛋白酶212Cys25,His159羧肽酶A307Arg127,Glu270,Tyr248,Zn2+（2）酶的活性部位是一个三维实体（3）酶的活性部位和底物的结合是一个动态辨认过程（诱导契合，induced-fit）（4）酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂隙（crevice）内，裂隙内是一个相当疏水的环境，从而有利于同底物的结合（5）底物靠许多弱的键力与酶结合（6）酶活性部位具有柔性或可运动性已糖激酶的三级结构中两个结构域之间有一裂沟频率最高的活性中心的氨基酸残基：Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。不需要辅酶的酶：活性中心是由酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基的某些基团组成。需要辅酶的酶：辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分酶蛋白必需残基非必需残基活性中心活性中心外接触残基辅助残基结构残基结合残基催化基团1960年koshland将酶分子的氨基酸残基分为4类(了解)：下列关于酶的活性中心的叙述哪些是正确的?

A.所有的酶都有活性中心

B.一个酶只有一个活性中心

C.所有酶的活性中心都有辅酶D.酶的必需基团都位于活性中心点内

E.所有酶的活性中心都含有金属离子

F.所有抑制剂都作用于酶的活性中心－－－－－－上海交大别构效应物与酶结合的部位是:

a.活性中心的底物结合部位

b.活性中心的催化基团

c.酶的-SH

d.活性中心以外的特殊部位

e.活性中心以外的任意部位

－－－－上海交大3研究活性中心的方法（1）酶的专一性研究（2）酶分子侧链基团的化学修饰法（3）X射线晶体衍射法（4）定点诱变法3、研究活性中心的方法（1）酶的专一性研究通过研究酶的专一性底物的结构特点，来判断和确定活性中心的结构特点，来判断和确定活性中心的结构。另外，研究酶的竞争性抑制剂的必需结构以及酶与专一性底物的相近关系也有助于了解酶活性中心的结构。

3、研究活性中心的方法（1）酶的专一性研究（2）酶分子侧链基团的化学修饰法（3）X射线晶体衍射法（4）定点诱变法3、研究活性中心的方法（2）酶分子侧链基团的化学修饰法

①

非特异共价修饰法在不引起酶蛋白变性的条件下，用某种专一性的化合物与酶分子中某种氨基酸侧链基团共价结合，改变基团的结构与性质，然后测酶活力，若酶分子失活，说明该基团为必需基团。酶分子可以被化学修饰的基团很多，如巯基、羟基、咪唑基、氨基、羧基和胍基。对羟汞苯甲酸ICH2COOH②特异性共价修饰某一种化学试剂专一的修饰酶活性部位的某一氨基酸残基，使酶失活。通过水解分离带标签的肽段，即可判断出被修饰的活性部位的氨基酸残基。如二异丙基氟磷酸可专一与胰凝乳蛋白酶活性中心的Ser的羟基共价结合Ser195外27个丝氨酸也不结合一些酶活性部位的氨基酸顺序酶氨基酸顺序牛胰蛋白酶……Ser-Cys-Gly-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val……牛胰凝乳蛋白酶……Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu……猪弹性蛋白酶猪凝血酶……Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu…………Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro……

③亲和标记法

这类修饰剂的结构类似于底物结构，有两个特点：可比较专一的引入酶的活性中心具有活泼的化学基团如卤素，可与活性中心的某一基团共价结合，使酶被修饰因其作用机制是利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记，故称为亲和标记。活性部位指示试剂胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶分子中有二个HIS残基（40，57），与TPCK烷化后经水解，只与57位结合3研究活性中心的方法（1）酶的专一性研究（2）酶分子侧链基团的化学修饰法（3）X射线晶体衍射法（4）定点诱变法（3）X射线晶体衍射法该法可解析酶分子的三维结构，有助于了解活性部位氨基酸残基所处的相对位置与实际状态，以及与活性部位有关的其他基团；研究酶与底物结合模式。X射线晶体衍射法确定了溶菌酶基团Glu35/Asp523研究活性中心的方法（1）酶的专一性研究（2）酶分子侧链基团的化学修饰法（3）X射线晶体衍射法（4）定点诱变法（4）定点诱变法如将胰蛋白酶Asp102诱变为Asn102，突变体水解酯的活性仅为天然酶的1/10000，可见Asp102对胰蛋白酶催化活性是必需的再如，羧肽酶A中的Tyr248原认为催化所必需，1985年Gardell等人把Tyr248的密码子（TAT）变为Phe的密码子（TTT）。发现突变酶的kcat值和天然酶一样，但其Km值高出6倍。第二节

酶的作用机理

一

、酶的活性中心

二、

酶的专一性的机理

三、

高效性的机理二、

酶的专一性的机理（一）专一性的类型

（二）酶作用专一性的机制

1、锁钥学说—lockandkey或模板学说（temolate）：1894年，Fischer提出了该学说，认为酶和底物在结构上严格互补，犹如钥匙与锁的关系，若底物结构稍有变化，就不能与酶结构相吻合。缺陷：不能解释酶的多底物现象、酶对正反方向的催化、相对专一性

酶促反应多数是可逆反应，S←→P，这就产生了一只钥匙开2把锁的情况，是无法解释的。：2、三点附着学说—(three-pointattachmenttheory)

：该学说是A．Ogster在研究甘油激酶催化甘油转变为磷酸甘油时提出来的其要点是：立体对映体中的一对底物虽然基因相同，但空间排布不同；那么这些基团与酶活性中心的有关基团能否互相匹配不好确定。只有三点都相互匹配时，酶才能作用于这个底物。以上两种学说都把酶和底物之间的关系认为是“刚性的”，只能说明底物与酶的结合，不能说明催化。因此属于“刚性模板”学说。潜手性专一性

有些酶对在有机化学上属于对称分子中的两个等同的基团，只催化其中一个，而不催化另一个。如：

H2C－OH│HC－OH│H2C－OH甘油甘油激酶ATPADP

H2C－O－P=O│HC－OH│H2C－OHO_O_

-磷酸甘油

酶作用专一性的机制

3、诱导契合学说-inducedfit为了修正锁钥学说的不足，1958年D.Koshland提出诱导契合学说，该学说认为酶的活性中心并不是和底物的形状正好互补的，但当酶与底物靠近时，底物能够诱导酶的构象发生变化，使其活性中心变得与底物的结构互补。就好像手与手套的关系一样。活性部位构象的变化是可逆的，反应结束产物脱落时，酶又恢复原构象。4什么是酶的活性部位,如何用来解释酶的专一性?

----北师大第二节

酶的作用机理

一

、酶的活性中心

二、

酶的专一性的机理1.专一性的类型2.专一性的学说三、

高效性的机理第二节

酶的作用机理

一

、酶的活性中心

二、

酶的专一性的机理

三、

高效性的机理三、

高效性的机理*邻近效应：酶与底物形成中间复合物，使底物之间(如双分子反应）、酶的催化基团与底物之间相互靠近，相当于变分子间反应为分子内反应，提高了反应基团的有效浓度，反应速度大大增加。1、邻近效应与定向效应定向效应：指底物的反应基团之间、酶的催化基团与底物的反应基团之间正确取向而使反应速度增加的效应.2、底物分子中的敏感键扭曲变形（distortion）

酶-底物复合物形成时，酶分子和底物分子构象都要发生变化;

甚至使底物分子发生扭曲变形，从而使底物分子某些键（旧键）的键能减弱，产生键扭曲，有助于过渡态的中间产物形成,从而降低了反应的活化能。酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力，使敏感键的一端更加敏感,底物分子发生形变,接近过渡态,降低了底物的活化能底物形变相对水解反应速率如乙烯环磷酸酯的水解速率是磷酸二酯水解速率的108倍,因为环磷脂的构象更接近于过渡态3、

酸碱催化酸-碱催化是指催化剂通过瞬时地向反应物提供质子或从反应物汲取质子，以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。酸催化：HA+S↔SH++A-

底物质子化

SH+

↔H++PS

H+不稳定迅速转化碱催化：A-+HS↔HA+S-

从底物汲取质子

S-

↔PS-

不稳定迅速转化酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。前者指催化剂是酸或碱，后者指催化剂是质子供体或质子受体。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸－碱催化方式。酶分子中可以作为广义酸、碱的基团(1)酸碱强度(pK值）：组氨酸咪唑基的解离常数为6，在中性条件下，一半以酸的形式存在，一半以碱的形式存在，即可给出质子又可结合质子，是最活泼的催化基团。(2)给出质子或结合质子的速度：咪唑基最快，半寿期小于10-10秒(3)酸碱基团，亲核基团His的咪唑基是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能基团质子供体质子受体组氨酸为什么常常出现在酶的活性中心？催化剂通过提供电子对或汲取电子对而与底物迅速形成反应活性很高的共价中间物，此中间物易变成过渡态，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。4、共价催化共价催化包括：亲核催化和亲电催化酶中参与共价催化的基团主要包括：亲核基团（提供电子对）：对底物具有部分正电性的原子（亲电中心）进行攻击，形成共价中间物。

His的咪唑基，Cys

的硫基，Ser的羟基等；-CH2-S∶-CH2-O∶HH亲电子基团（电子对受体）：攻击底物分子中富含电子或带部分负电荷的原子，形成共价中间物。亲电子催化在酶催化反应中很少见。亲电子基团主要有：H+、Mg2+、Mn2+、Fe3+:H2N－CH－C－OH‖OCH2│SH│::辅酶A的结构

焦磷酸硫胺素‥NH3CHOCHOCH2OPOHOOH磷酸吡哆醛‥:C近1/3的酶催化活性需要金属离子，根据金属离子-蛋白质相互作用强度将需金属的酶分为：金属酶（metalloenzyme):含有紧密结合的金属离子，多属于过渡态金属离子如Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+金属-激活酶（metal-activatedenzyme):含松散结合的金属离子，通产为碱和碱土金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+5、金属离子的催化作用金属离子的催化作用：提高水的亲核性能：金属离子可以和水分子的OH-结合，使水显示出更大的亲核催化性能。电荷屏蔽作用许多激酶为ATP-Mg2+复合物。电子传递中间体：作为酶的辅因子起传递电子的功能。CO2＋H2OHCO3－＋H＋多劳并非多得——简单博弈借力获利如激酶的底物是Mg2+-ATP:Mg2+作用是定向效应及屏蔽负电荷腺嘌呤—核糖—O—P—O—P—O—P—O-OOOO-O-O-

Mg2+Mg2+Mg2+6、多元催化和协同效应多个基团催化形式的协同作用。一般包括酸-碱催化，共价催化（亲核催化,亲电子催化）等。如凝乳蛋白酶：Ser-195亲核催化，His-57酸碱催化等；酶分子活性中心是一个疏水环境，介电常数低，加强极性基团间的作用。7、

活性中心的微环境第二节

酶的作用机理

一

、酶的活性中心

二、

酶的专一性的机理

三、

高效性的机理1.邻近效应和定向效应2.底物形变3.酸碱催化4.共价催化5.金属离子的催化6.多元催化和协同催化7.活性中心的微环境四、酶催化反应机制的实例（一）溶菌酶（lysozyme）（二）胰核糖核酸酶（RNaseA）（三）羧肽酶A（四）丝氨酸蛋白酶四、酶催化反应机制的实例分子量14.6×103，由129个氨基酸组成，含有4对二硫键溶菌酶催化水解NAM及NAG间的糖苷键NAM:N-乙酰氨基葡萄糖乳酸NAG:N-乙酰氨基葡萄糖O18水中水解作用指出溶菌酶催化底物C1-O键裂解溶菌酶的催化作用第一步是质子转移,糖苷键被裂解,形成一个正碳离子中间物GLU35和糖苷键氧原子的距离为0.3NM，正是合适的作用距离分析D-E键周围的微环境，最活活泼的基团显然是ASP52和GLU35，它们分别位于糖苷键两侧，ASP52是在一个明显的极性环境中，在那里它在一个复杂的氢键网络中起着氢键的受体作用。相反，GLU35位于非极性区，这样在PH5下，这是溶菌酶水解几丁质最适PH，谷氨酸侧链的PK值为4.25AspPK3.86正羰离子中是产物的形成和稳定，一方面ASP52的负离子稳定住了D环C1的正电荷，同时使D环的椅式变为半椅式，因此可以说，酶在结合底物时，酶迫使底物采取了接近了过渡态的构象。形成碳正离子时葡萄糖环的形变因此可以说，酶在结合底物时，酶迫使底物采取了接近了过渡态的构象。溶菌酶催化作用第二步是OH-和H+分别加合到正碳离子中间物和Glu35的侧链后,水解反应完成溶菌酶催化水解NAM及NAG间的糖苷键（一）溶菌酶（lysozyme）（二）胰核糖核酸酶（RNaseA）（三）羧肽酶A（四）丝氨酸蛋白酶四、酶催化反应机制的实例（一）溶菌酶（lysozyme）（二）胰核糖核酸酶（RNaseA）（三）羧肽酶A（四）丝氨酸蛋白酶四、酶催化反应机制的实例ZnZn羧肽酶活性中心示意图Tyr248Arg145Glu270底物H2O1961.二肽的Tyr侧链进入酶的疏水口袋，该口袋适合于芳香侧链和大的脂肪铡链，这就解释了该酶选择的底物要有大的疏水侧链2.活性部位的Zn直接同断裂肽键羰基氧配位，该底物有效的置换预先占据位置的水分子3.Arg145的胍基移动大约0.2nm，同底物末端羧基形成一个静电键，Glu270与底物结合也经历了同样的位移4.当底物的Tyr侧链与活性口袋结合时，至少有另外4个水分子从其中被置换出来，最大的构象变化是羧肽酶Tyr248的酚羟基移动了1.2nm，大约相当于这个蛋白分子直径的1/4的距离。这个移动主要是通过Tyr248Ca-Cb单键转动而实现的。Tyr248的羟基从分子表面移动到底物肽键附近，并完成了这个空腔从由水充填的区域成为疏水区域的转化。这些结构的变化可能是通过Arg145结合到底物的末端羧基上引起的，羧肽酶A与底物结合，引导起构象的改变，正是诱导契合的典型例证。羧肽酶A的作用机制羧肽酶A在结合底物后发生变化羧肽酶A裂解模式底物苯甲酰甘氨酰苯丙氨酸的机制四、酶催化反应机制的实例（一）溶菌酶（lysozyme）（二）胰核糖核酸酶（RNaseA）（三）羧肽酶A（四）丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶是一类最有特色的酶家族。这个家族中包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、枯草杆菌蛋白酶、纤溶酶、组织纤溶酶原激活剂；乙酰胆碱酯酶丝氨酸蛋白酶举例酶来源功能胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶凝血酶血纤维蛋白溶酶补体C1激肽释放酶顶体蛋白酶溶酶体蛋白酶α-Lytic蛋白酶蛋白酶A和B枯草杆菌蛋白酶胰脏胰脏胰脏脊椎动物血清脊椎动物血清血清血和组织精子顶点动物细胞BacillussorangiumStreptomycesgrisewsBacillussubtillus消化蛋白消化蛋白消化蛋白血液凝固血块溶解免疫应答中的细胞溶胞作用控制血流穿透卵细胞细胞蛋白周转可能与消化有关胰凝乳蛋白酶结构胰凝乳蛋白酶

的作用机理AspHisSer胰凝乳蛋白酶的活性中心活性中心必需基团:His57,Asp102,Ser195胰凝乳蛋白酶分子中催化中的三联体构象His57Asp102Ser195Asp102His57Ser195His57102AspSer195酶分子中的电荷接力网氢键体系-电荷接力网胰凝乳蛋白酶活性中心的氢键体系-电荷接力网胰凝乳蛋白酶的催化过程A.酶与底物结合，形成米氏复合物（ES）B.形成四联体过渡态中间物E.形成包括水分子的四联体过渡中间物F.羰基产物形成，酶游离除了胰凝乳蛋白酶外，在催化中具有“天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸”电荷按力网的酶还有：胰蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶功能：在动物小肠中催化蛋白质的水解活性中心重要基团:His,Asp,Ser第二节

酶的作用机理

一

、酶的活性中心

二、

酶的专一性的机理

三、

高效性的机理1.邻近效应和定向效应2.底物形变3.酸碱催化4.共价催化5.金属离子的催化6.多元催化和协同催化7.活性中心的微环境第一章

酶的基础知识酶学概论酶的作用机理酶促反应动力学第三节

酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素的科学（底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等）。意义：研究酶的结构与功能的关系及酶的作用机制，需要动力学提供实验证据。寻找最有力的反应条件，以发挥酶催化反应的高效率。了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制。一、

底物浓度对酶促反应速度的影响二、

多底物的酶促反应动力学第三节

酶促反应动力学三、

pH对酶促反应速度的影响四、温度对酶促反应速度的影响六、激活剂对酶反应速度的影响五、酶浓度对酶反应速度的影响（一）中间复合物学说与米式方程1、中间复合物学说2、米式方程（二）

米式方程的导出

1、

1913年的米式方程基于快速平衡假说2、

“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展（三）

米式方程中各参数的意义1、快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别2、Km的物理意义3、Km与天然底物4、Km、Ks与底物亲和力5、Km与米式方程的实际用途6、Vmax与K3（Kcat）的意义（四）

Km和Vmax的求解方法（一）中间复合物学说与米式方程一、

底物浓度对酶促反应速度的影响（单底物酶促反应）1903Henri1913年Michaelis和Menten

根据中间复合物学说，推导出一个数学方程式1925Briggs和Haldane提出稳态理论1903Henri[sucrose]Venzymesucrose+H2Oglucose+fructose1903年Henri用蔗糖酶水解蔗糖做试验，研究底物浓度与反应速度的关系，当酶浓度不变时,可以测出一系列不同底物浓度下的反应速度，以反应速度对底物作图，得到双曲线：一级反应混合级反应零级反应酶与底物先络合成一个中间复合物，然后中间复合进一步分解成产物和游离的酶。1、中间复合物学说：（根据实验结果，Henri和Wurtz提出)根据中间产物学说可解释曲线当[S]很小时，酶未被底物饱和，这是V取决于底物浓度。随着[S]变大，根据质量作用定律，ES生成也最多，而V取决于ES的浓度，故反应速率也随之增高。当[S]相当高时，溶液中的酶全部被底物饱和，虽增加[S]浓度，也不会有更多的中间复合物生成，因此V与S无关，达到Vmax。在酶浓度恒定的条件下（1）ES复合物已被电子显微镜和X-射线晶体结构分析直接观察到。如：在电子显微镜下可观察到DNA聚合酶Ⅰ可结合到DNA膜板上。X-射线晶体结构分析，研究羧肽酶A和它的底物Gly-Tyr的相互作用及其作用位置。中间复合物学说证据：（2）许多酶和底物的光谱特性在形成ES复合物后发生变化如色氨酸合成酶，含有一个磷酸吡哆醛辅基，该酶催化：吲哚+Ｌ－丝氨酸→Ｌ－色氨酸加Ser到酶中磷酸吡哆醛的荧光显著增加，随后加吲哚使荧光粹灭到低于单独酶的水平揭示酶-Ser和酶-Ser-吲哚复合物的存在。色氨酸合成酶（3）酶的物理性质，如溶解度或热稳定性，经常在形成ES复合物后发生变化。

（4）已分离到某些酶与底物相互作用生成的ES复合物，如已得到乙酰化胰凝乳蛋白酶及D-氨基酸氧化酶和底物复合物的结晶。

（5）超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降现象。1913年Michaelis和Menten

根据中间复合物学说，推导出一个数学方程式：

表示了底物浓度与酶反应速度之间的定量关系，称为米氏方程。Ks为ES的解离常数（底物常数）2、米式方程：（一）中间复合物学说与米式方程1、中间复合物学说2、米式方程（二）

米式方程的导出

1、

1913年的米式方程基于快速平衡假说2、

“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展（三）

米式方程中各参数的意义1、快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别2、

Km的物理意义3、

Km与天然底物4、

Km、Ks与底物亲和力5、

Km与米式方程的实际用途6、

Vmax与K3（Kcat）的意义（四）

Km和Vmax的求解方法（二）

米式方程的导出：①在反应的初始阶段，[S]远远大于[E]，因此，[S]可以认为不变。②

因为研究的是初速度，P的量很小，由P+E

ES可以忽略不记。③游离的酶与底物形成ES的速度极快（快速平衡），而ES形成产物的速度极慢，故，[ES]的动态平衡与ES

P+E没有关系。（即K1、K2＞＞K3）K1、K2、K3为反应的速度常数1、

1913年的米式方程基于快速平衡假说ES的生成速度：K1（[E]-[ES]）[S]ES的分解速度：K2[ES]平衡时：K1（[E]-[ES]）[S]=K2[ES]设[E]为总酶浓度[ES]为中间复合物浓度[E]-[ES]为未与底物结合的游离状态的酶浓度[S]为底物浓度反应速度：KS现在称为底物常数

而K3[E]=Vmax1925Briggs和Haldane提出稳态理论[ES]的动态平衡不仅与E+SES有关，还与ES

P+E有关。即K1、K2＞＞K3

不一定成立。所谓稳态是指反应进行一段时间后，系统的复合物ES浓度，由零逐渐增加到一定数值，在一定时间内，尽管底物浓度和产物浓度不断地发生变化，复合物ES也不断地生成和分解，但是当反应系统中ES的生成速率和ES的分解速率相等时，络合物ES浓度保持不变的这种反应状态称为稳态，2、

“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展：K4ES生成速度：k1（[E]-[ES]）[S]ES分解速度：k2[ES]+k3[ES]以上两个速度相等：k1（[E]-[ES]）[S]=k2[ES]+k3[ES]用稳态假说推导米式方程：K4（米氏常数）V=Vmax[S]Km+[S]（1）当[S]《Km时当Km及Vmax已知时，根据米氏方程可确定酶反应速度与底物浓度的关系:即[S]《Km时，反应速度与底物浓度成正比，因为此时底物浓度低，酶没有全部被底物所饱和，因此在底物浓度低条件下，是不能正确测得酶活力的。（2）当[S]》Km时当[S]》Km时，反应速度达到最大，这时酶全部被底物饱和，只有在此条件下才能正确测得酶活力。（3）当[S]=Km时（一）中间复合物学说与米式方程1、中间复合物学说2、米式方程（二）

米式方程的导出

1、

1913年的米式方程基于快速平衡假说2、

“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展（三）

米式方程中各参数的意义1、快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别2、Km的物理意义3、Km与天然底物4、Km、Ks与底物亲和力5、Km与米式方程的实际用途6、Vmax与K3（Kcat）的意义（四）

Km和Vmax的求解方法（三）

米式方程中各参数的意义1、快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别当K1、K2》K3时，即ES

P+E是整个反应平衡中极慢的一步：稳态平衡=“快速平衡+慢速平衡”：当ES

P+E极慢（K3/K1极小）时，稳态平衡基本等于快速平衡K42、

Km的物理意义当反应速度v=1/2Vmax时，Km=[S]Km的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度一半时底物的浓度。单位：mol·L-1或mmol·L-1Km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质而与酶的浓度无关；随底物种类及反应条件（温度、Ph、离子强度）而变化。因此，Km作为常数只是对一定的底物，pH、温度和离子强度等条件而言。故对某一酶促反应，在一定条件下都有特定的Km，可用来鉴别酶。如判断来源不同但催化相同反应的酶是否属于同一种酶。其中Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为Km愈小（达到Vmax一半所需的底物浓度愈小）表示V对△[S]

越灵敏。V[S]1/2VmaxKm3、

Km与天然底物有的酶可作用与几种底物，因此有几个Km

Km值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径

例如：ABCD若它们相应底物A、B、C的Km分别为10－2、10－3、10－4mol/L，而细胞内ABC浓度都接近10－4mol/L，则可推测限速步骤？123多酶体系中：丙酮酸

乳酸

Km＝1.7×10－5mol/L丙酮酸

乙酰辅酶AKm＝1.3×10－3mol/L丙酮酸

乙醛Km＝1.0×10－3mol/L4、

Km、Ks与底物亲和力Km是ES分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES解离趋势（K2／K1）和产物形成趋势（K3／K1）。Ks是底物常数，只反映ES解离趋势（底物亲和力），1/Ks可以准确表示酶与底物的亲和力大小。只有当K1、

K2》K3时，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物亲和力的大小。K4问题：（1）

Km越小，底物亲和力越大(x)（2）

Ks越小，底物亲和力越大(√）（3）天然底物就是Km值最小的底物(√)（4）底物亲和力越大酶促反应速度越大(x)5、

Km与米式方程的实际用途（2）根据V/Vmax求[S]（1）根据[S]求相对速度V/Vmax[S]0.9=9Km同理有：[S]0.8=4Km[S]0.7=2.33Km[S]0.6=1.5Km[S]0.5=1Km[S]0.1=1/9Km[S]0.9/[S]0.1=81[S]0.7/[S]0.1=21设定v达到Vmax的0.9倍时，所需底物浓度为[S]0.9（2）根据V/Vmax求[S]当v=Vmax时，表明酶的活性部位已全部被底物占据，v与[S]无关，只和[Et]成正比。当v=1/2Vmax时，表示活性部位有一半被占据。（3）根据相对速度推测酶活性中心饱和度Y：在一定的酶浓度下，酶对特定底物的Vmax是一个常数，它只与底物的种类及反应条件有关。Vmax=K3[E]K3代表酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数（或催化常数，Kcat），Kcat越大，表明酶的催化效率越高。6、

Vmax与K3（

Kcat）的意义（一）中间复合物学说与米式方程1、中间复合物学说2、米式方程（二）

米式方程的导出

1、

1913年的米式方程基于快速平衡假说2、

“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展（三）

米式方程中各参数的意义1、快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别2、

Km的物理意义3、

Km与天然底物4、

Km、Ks与底物亲和力5、

Km与米式方程的实际用途6、

Vmax与K3（Kcat）的意义（四）

Km和Vmax的求解方法（四）

Km和Vmax的求解方法1、

Lineweaver-Burk

双倒数作图法两侧取倒数，得1/Vmax-1/Km1/[S]1/V斜率=Km/Vmax测不同[s]下，相应的反应速度，以1/v对1/s作图，得一直线：缺点是：低S浓度时，v很小，本身容易产生误差，而倒数后误差显著放大。2、

Eadie-HofsteeV—V/[S]作图法将米氏方程改写为：

V=Vmax－Km·V/[S]以V对V/[S]作图，得一直线，其纵轴截距为Vmax,斜率为-KmV/[S]V3、Hanes-Woolf作图法将双倒数形式两边均乘以[S]，得：[S]/V=Km/Vmax+[S]/Vmax以[s]/v对[s]作图，得一直线，横轴截距为-Km,斜率为1/Vmax[s][S]/V-Km（一）中间复合物学说与米式方程1、中间复合物学说2、米式方程（二）

米式方程的导出

1、

1913年的米式方程基于快速平衡假说2、

“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展（三）

米式方程中各参数的意义1、快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别2、

Km的物理意义3、

Km与天然底物4、

Km、Ks与底物亲和力5、

Km与米式方程的实际用途6、

Vmax与K3（Kcat）的意义（四）

Km和Vmax的求解方法提问？关键酶的特点:代谢途径中决定反应的速度和方向的酶称为关键酶。它有三个特点：1、它催化的反应速度最慢，所以又称限速酶。其活性决定代谢的总速度。2、它常常催化单向反应，其活性能决定代谢的方向。3、它常常受多种效应剂的调节。一、

底物浓度对酶促反应速度的影响二、

多底物的酶促反应动力学第三节

酶促反应动力学三、

pH对酶促反应速度的影响四、温度对酶促反应速度的影响六、激活剂对酶反应速度的影响五、酶浓度对酶反应速度的影响瘙痒感觉可以“传染”BritishJournalofDermatology

DOI:10.1111/j.1365-2133.2011.10318.x研究人员说，这些现象证明瘙痒感觉的确会“传染”，这可能是因为人的大脑中有一种特殊机制，这种机制只要接收到别人挠痒甚至只是说起痒的信号，就会将其转换成觉得自身发痒的信号。过去曾有研究显示猴子等动物中也存在这种情况，研究人员因此认为，这可能是因为猴子和人类的共同祖先生活在关系紧密的集体中，如果某个成员因身上出现虱子等寄生虫而挠痒，其他成员看见后也开始挠痒，这有助于控制寄生虫的传播，长此以往就逐渐形成了瘙痒感觉的“传染”机制。（生物谷B）许多人都有这样的经历，看见别人挠痒，自己身上某个地方也不由自主地痒起来。一项最新研究认为，人的瘙痒感觉的确会“传染”，这可能是人类在进化过程中形成的一种大脑活动机制。新一期《英国皮肤病学杂志》（BritishJournalofDermatology）刊登报告说，美国韦克福雷斯特大学等机构研究人员请一些志愿者参与相关实验，志愿者分别观看一段有人挠痒或不挠痒的视频。结果显示，观看有人挠痒视频的志愿者，更多地出现挠痒行为，其频率约是其他人的两倍。此外，这些志愿者手臂上还分别被点上能引起瘙痒感觉的药水或普通盐水，结果显示，观看有人挠痒短片且手臂上点有药水的志愿者不仅抓挠点了药水的部位，还会胡乱地抓挠身上其他部位，这说明并不只是药水引起了瘙痒的感觉。2011-3-29

Science特刊：向癌宣战四十年

1971年12月，时任美国总统理查德·尼克松签署《国家癌症法》，扩大国家癌症研究所的规模、职责和范围，创立国家癌症研究计划，目标是通过大规模增加研究经费，消除癌症带来的死亡，吹响了美国向癌症宣战的号角。2011年3月，美国《科学》杂志发表向癌症进军40年特刊，庆祝《国家癌症法》颁布40周年。经过40年的战斗，成效如何？从1990年开始，美国癌症的发生率和死亡率开始下降，但今天，癌症仍然是美国和世界导致死亡的主要疾病，多种癌症仍不可治愈，癌症研究已成为国际社会共同努力的事业，人类抗癌之路依然漫长、艰巨。向癌症开战1971年12月，在尼克松签署《国家癌症法》时，科学家们已经开始思考和攻克一些棘手难题。有人质疑：40年后，癌症研究人员仍然还在设法解决同样的问题，癌症研究好像没有什么进展。《科学》的文章认为这有一部分是事实，但重要的是，自从尼克松第一次“向癌症宣战”时，癌症战役已经改变了治疗方法、挽救了生命。文章列举了40年来的重要事件：1978年，美国开始了第一个癌症生物学治疗方法——α干扰素的临床试验，美国食品和药物管理局（FDA）批准抗雌性激素它莫西芬（tamoxifen）用于预防乳腺癌的复发；1980年，罗伯特·加洛和其他人分离出人类T细胞嗜淋巴细胞病毒1型，这是一种引发癌症的病毒；1983年，研究人员创建出几种联合免疫缺陷小鼠，作为癌症研究的模式动物；1985年，对乳腺癌患者的随机临床对比实验显示，乳房肿瘤切除手术加上放射性治疗，其效果与乳房切除手术一样；1989年，诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家哈罗德·瓦尔默斯和迈克尔·毕晓普，以表彰他们发现了第一个原癌基因；1992年，FDA批准紫杉树皮衍合成生紫杉酚（Taxol）用于乳腺癌治疗；1996年，美国癌症协会和其他报告指出，美国癌症死亡率第一次呈现实质性下降，从1991年到1995年下降了2.6%；1998年，FDA批准单克隆抗体药物赫塞汀（Herceptin）用于治疗过度生产HER2的转移性乳腺肿瘤；1998年，诺贝尔奖获得者詹姆斯·沃森对《纽约时报》说，阻断肿瘤血管的生长能“在两年内治愈癌症”；2005年，国立卫生研究院（NIH）启动癌症基因图谱计划；2007年至2008年，乳腺癌发生率下降，主要归功于更好的扫描技术和荷尔蒙替代治疗法的减少；2010年，国家肺癌扫描试验发现，螺旋CT筛查能降低癌症吸烟者的癌症死亡率。FDA批准Provenge用于转移性前列腺癌的免疫治疗等。尽管如此，癌症在今天仍然是威胁人类的主要疾病，从1971年到现在，美国癌症死亡率的降低量并不令人满意，许多类型的癌症如前列腺癌等仍不可治愈。世界卫生组织在《2008年世界癌症报告》中指出，到2010年，癌症有望超过心脏疾病成为导致世界人口死亡的第一主要疾病。为什么癌症治疗如此令人沮丧？《科学》杂志总编辑布鲁斯·阿尔伯茨在为本期《科学》撰写的社论中指出，绝大多数癌症在被探测出来的同时，长大的肿瘤已经包含了上亿个癌细胞。通过许多年变异和自然选择，癌细胞学会了多变，能够逃离保护人类身体安全的许多失败保护机制。比如，凶猛的癌细胞规避了人体精致复杂的生长控制系统，打破了消灭异常细胞的细胞自杀机制，进化出对免疫系统监视的抵抗力。阿尔伯茨说：“我们如何能发现一种药物，在有效杀死患者体内的特定肿瘤时不会伤及维持生命的正常细胞？考虑到我们研究和操控细胞能力的提高，新方法的出现是可能的。““癌症是一种导致可怕死亡人数的疾病，对科学家们来说，预防和治疗这种疾病仍然是一项巨大的挑战。”阿尔伯茨在社论中说，“我们都曾知道某人罹患癌症，人们总是希望研究科学家集中精力立即开发出更好的治疗方法，但是，要研制出更强有力的治疗方法，最重要的是投资和长期的努力。”二、

多底物的酶促反应动力学酶促反应按底物分子数分类:单底物反应双底物反应三底物反应底物数酶分类催化反应酶种类占总酶的%单底物异构酶

AB5单向单底物裂合酶

AB+C12假单底物水解酶

AB+H2OAOH+BH26双底物氧化还原酶

AH2+BAOH+BH27

转移酶

A+BXAX+B24三底物连接酶

A+B+ATPAB+ADP+Pi6（一）双底物反应机制双底物反应根据反应过程中是否形成

三元络合物分为两类：序列反应：有序反应随机反应乒乓反应1、有序反应机理（orderedreactions,orderedBiBi)只有领先底物A首先与酶结合，然后B才能与酶结合，形成的三元复合物AEB（ternarycomplex)转变为QEP，B的产物P先释放，A的产物Q后释放。在缺少A时，B不能与E结合E→AE→AEB→QEP→QE→EABPQA与其产物Q相互竞争地结合EPEAAEAEBQEPBQEQ反应的总方向决定于A、Q的浓度和反应的平衡常数NAD与NADH相互竞争E上的NAD+结合部位需要NAD+的脱氢酶属于这种类型底物A、B与酶结合的顺序是随机的，形成的三元复合物AEB→QEP，产物P、Q的释放顺序也是随机的。

2.随机反应机理（randomreactions)(randomBiBi)限速步骤是AEB→QEPA与Q相互竞争E上的底物结合部位A；B与P相互竞争E上的底物结合部位B反应的总方向决定于A、B、Q、P的浓度和反应的平衡常数糖原与小糖原竞争E上糖原结合部位，Pi与G-1-Pi竞争E上Pi结合部位3、乒乓反应机理

Pingpongreactions（double-displacementreactions)底物A先与E结合成AE二元复合物，AE→PE

（修饰酶形式），释放第一个产物P，接着底物B与E

形成E

B，E

B→EQ，释放第二个产物QA与Q竞争自由酶形式E，B与P竞争修饰酶形式E

。整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三元复合物形式

谷氨酸：草酰乙酸氨基转移酶谷氨酸与天冬氨酸竞争性结合E-磷酸吡哆醛，α-酮戊二酸与草酰乙酸竞争性结合E

-磷酸吡哆胺（一）双底物反应机制双底物反应根据反应过程中是否形成三元络合物分为两类：序列反应：有序反应

随机反应

乒乓反应1、乒乓机制的动力学方程（二）双底物反应的动力学方程（了解）KmA和KmB分别为底物A和B的米氏常数，多底物反应中，一个底物的Km往往可随另一底物的浓度变化而变化。故KmA指在B的浓度达饱和时A的Km。而在B低于饱和浓度时所测得的随[B]而变化的A的各个Km,称为表观米氏常数；B同理。Vmax是指A和B均已达饱和时的最大反应速度。当[A]或[B]固定时,均为直线方程乒乓机制的动力学曲线是两组平行直线2、序列机制的底物动力学方程kSA为底物A与酶结合的解离常数序列机制的动力学曲线为一组交叉的直线（二）双底物反应的动力学方程（了解）（一）双底物反应机制双底物反应根据反应过程中是否形成三元络合物分为两类：序列反应：有序反应随机反应乒乓反应二、

多底物的酶促反应动力学小结一、

底物浓度对酶促反应速度的影响二、

多底物的酶促反应动力学第三节

酶促反应动力学三、

pH对酶促反应速度的影响四、温度对酶促反应速度的影响六、激活剂对酶反应速度的影响五、酶浓度对酶反应速度的影响三、

pH对酶促反应速度的影响在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常称此pH为最适pH(optimumpH)。高于或低于此值，反应速度下降。pH影响酶活力的原因：①环境过酸过碱影响酶蛋白构象，使酶本身变性失活。②影响酶分子活性部位有关基团的解离状态。③影响底物的解离状态。四.温度对酶促反应速度的影响一方面是温度升高,活化分子数增加，酶促反应速度加快。另一方面,随温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失，反应速度下降。因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度(optimumtemperature)条件下,反应速度最大。温度系数（Q10）:反应温度提高10OC,其反应速率与原来反应速率之比称为反应的温度系数，用Q10来表示。对大多数酶来说，温度系数多为2。五.酶浓度对酶反应速度的影响一定条件下，若底物浓度足够大（＞＞[E]），反应速度与酶浓度成正比。酶浓度对反应速度的影响[E]

六.激活剂对酶反应速度的影响凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂。按分子大小分为三类：⑴无机离子⑵中等大小的有机分子

⑶某些酶类激活剂⑴无机离子：①金属离子：K+,Na+,Mg2+,Zn2+,Fe2+,Ca2+是多种激酶及合成酶的激活剂。②阴离子:Cl-对动物唾液中的a-淀粉酶有激活作用③氢离子：对胃蛋白酶有激活作用激活剂（2）中等大小的有机分子：①某些还原剂：如半胱氨酸，还原型谷胱甘肽对以巯基为活性基团的酶起激活作用②乙二胺四乙酸（EDTA）：是金属螯合剂，能除去酶中的重金属杂质，从而解除重金属对酶的抑制作用。

激活剂(3)某些酶类：酶原激活过程中的酶类

无活性的酶原有活性的酶激活作用肠激酶对胰酶的激活胰蛋白酶原肠激酶胰蛋白酶糜蛋白酶原糜蛋白酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶羧基肽酶原(A及B)羧基肽酶(A及B)能降低酶催化反应速度的因素很多，通常将其分为（变性）失活作用和抑制作用两类。（激活、去阻遏）失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。抑制作用(inhibiton)：抑制作用是指在酶不变性的情况下，由于酶的必需基团化学性质的改变，使酶活力下降或丧失。变性剂对酶的变性作用没有选择性抑制剂对酶的抑制作用有选择性，一种抑制剂只能使一种酶或一类酶产生抑制作用。七、

抑制剂对酶促反应速度的影响（1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发（2）了解生物体的代谢途径，进行人为调控或代谢控制发酵（3）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：（一）抑制程度的两种表示方法相对活力分数(残余活力分数）相对活力百分数a%=Vi/V0×100%1、相对活力酶受抑制后活力降低的程度是研究酶抑制作用的一个重要指标，一般用反应速率的变化表示V0为不加抑制剂的反应速率Vi加入抑制剂后的反应速率2、抑制率抑制分数（被抑制而失去活力的分数）抑制百分数i%=(1－a)×100%=(1－Vi/V0)×100%根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，把抑制作用分为两大类：不可逆的抑制作用抑制剂与酶活性中心（外）的必需基团共价结合，使酶的活性下降或丧失，无法用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。可逆的抑制作用抑制剂与酶蛋白非共价键结合，使酶的活性下降或丧失，可以用透折、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。（二）抑制作用的类型可逆抑制剂又可通过两种不同的方式与酶结合而抑制酶的活性。方式一抑制剂与酶的活性中心相结合，阻断酶分子的结合基团或催化基团，或与酶-底物中间复合体结合，从而阻止底物形成产物。这类抑制剂在酶分子上的结合部位基本上和底物相同或相近，故称为同位抑制剂，这种抑制作用叫做竞争性抑制作用(同位抑制作用)。抑制剂和酶分子活性中心以外的部位相结合，通过酶分子空间构象的改变影响底物与酶的结合。由于抑制剂与酶的结合部位不同于底物的结合部位，故这种抑制剂称为别位抑制剂或别构抑制剂。这类抑制作用也就叫作非竞争性抑制作用（别构抑制作用）。可引起别构作用的酶称为别构酶，别构酶大多是有一个亚基的寡聚体酶。方式二1、通过透析、超滤及凝胶过滤等2、通过V-[E]曲线：

（三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别通过V-[E]曲线在测定酶活力系统中加入一定量的抑制剂，然后测定不同酶浓度的反应初速度，以初速度对酶浓度作图。通过V-[E]曲线可逆抑制与不可逆抑制剂的区别（二）A:可逆抑制的作用B:不可逆抑制的作用（四）可逆抑制作用根据抑制剂与底物的关系分为3类：竞争性非竞争性反竞争性其他类型（1）概念：

指抑制剂和S对E的结合有竞争作用，互相排斥。已结合S的ES复合体不能再结合I，已结合I的EI复合体也不能再结合S，故不可能存在IES三联复合体。1、竞争性抑制（Competitiveinhibition）

E+SESP+E+IEI可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。竞争性抑制剂和底物竞争与酶结合并与底物互相排斥是由于抑制剂与底物结构类似。丙二酸、戊二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制某些药物或体内代谢物对酶的竞争性抑制作用:

磺胺类药物及其作用机理

对氨基苯磺酰胺是对氨基苯甲酸的结构类似物，竞争性抑制细菌的二氢叶酸合成酶活性蝶呤对氨基苯甲酸Glu二氢叶酸合成酶二氢叶酸四氢叶酸嘌呤核苷酸二氢叶酸还原酶一碳单位磺胺类药物磺胺类药物的抗菌机理氨甲蝶呤尿嘧啶＋1-磷酸核糖尿嘧啶核苷+Pi尿嘧啶核苷磷酸化酶尿酸——人和猿类、鸟、昆虫、爬行动物

(痛风症)痛风是一种嘌呤(Purine)代谢失调的疾病，临床特点是血尿酸升高。身体过量的尿酸，会结成晶体，沉积在关节内，引起剧痛。通常大拇扯首先发热红肿，一下即疼痛无比，活动困难。再严重时会影响膝、腕及踝关节，造成关节畸形僵硬。慢性痛风可导致肾结石、痛风性肾病等。